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菠萝(Ananas comosus)是重要的热带果树,极易遭受低温影响,7℃左右便出现寒害。低温寒害成为制约我国菠萝产业发展的重要因素,选育抗寒能力强的优良品种和探讨其抗寒机理已成为菠萝科研生产中亟待解决的问题。本研究以经过连续3轮低温筛选后(0℃+72 h、0℃+72 h、0℃+96 h)的3个菠萝初选抗寒细胞株系(J-5-S、K-6-S、K-7-S)为材料,用植物生理学、形态学、细胞学和分子生物学等方法进行检测分析,并以低温处理对它们进行了进一步的低温复选。主要研究结果如下:气孔密度观察结果显示,初选抗寒细胞株系气孔密度低于普通‘神湾’株系。利用流式细胞仪对3个初选抗寒细胞株系进行分析后发现J-5-S株系细胞染色体数目出现了加倍(四倍体),而J-5-S、K-6-S及对照株系仍为二倍体。利用ISSR分子标记技术对3个初选初选抗寒细胞株系愈伤组织进行了DNA多态性分析显示出现多态性条带,26条ISSR引物中共筛出5条能扩增出清晰的多态性标记,其中3个引物在3个初选抗寒细胞株系中扩增结果中出现多态性条带,2个引物仅在初选抗寒细胞株系(K-6-S)中出现多态性条带。遗传差异分析表明初选抗寒细胞株系发生了不同程度的变异,且J-5-S、K-6-S的遗传变异更为丰富。利用荧光定量PCR对课题组前期经转录组筛选的24个差异基因进行表达分析结果显示,在初选抗寒细胞株系(K-6-S)与普通‘神湾’株系冷冻处理0h、4h、12h、24h、72h后,7个差异基因上调表达并显著高于对照,5个差异基因的表达趋势和表达量与对照基本一致,1个差异基因下调表达并与对照表达量相近;而在低温响应的调控网络中发挥重要作用的ZAT10、MYB73,多次验证表明它们在初选抗寒细胞株系中的表达量比对照上调显著。选用大小与普通‘神湾’株系较为一致的2个抗寒细胞株系(J-5-S、K-6-S)为材料,进行了半致死温度测定和低温处理结果表明:2个初选抗寒细胞株系半致死温度分别比对照低0.42℃和2.51℃,而低温处理(-4℃+12 h)后3个株系植株全部死亡,低温处理(-2℃+12 h)后J-5-S、K-6-S存活率分别为11.1%、16.7%,抗寒能力均优于对照。从两种处理方法的结果差异可知,直接使用低温处理比半致死温度测定法所得的耐寒温度要高,而低温处理法更接近自然条件下菠萝实际耐寒温度。在已建立的菠萝初选抗寒细胞株系离体培养体系的基础上利用直冷型冰箱进行更严格的低温(-2℃+72 h)复选,K-6-S、J-5-S、K-7-S株系低温复选后体细胞胚存活率分别为1.38%、3.85%、5.27%;利用风冷型冰箱对再生植株低温复选(-2℃+48h)的平均存活率分别为:4.23%、10.29%、34.00%,而对照全部死亡。两项指标均表明K-7-S抗寒力强于其它两个初选抗寒细胞株系。