第一部分：骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的：掌握大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增的方法，并探讨其生物学特性。方法：无菌条件下取出大鼠双侧股骨、胫骨，用L-DMEM反复冲洗骨髓腔，收集细胞，离心，去上清，重悬，计数后，置于含10％FBS的L-DMEM完全培养基中，37℃、5％C02环境下进行培养，应用全骨髓培养法结合贴壁分离的方法进行纯化。待细胞达90％融合时，胰酶消化2~3min后进行传代。倒置显微镜下观察原代及传代后的细胞生长特点。用计数法绘制大鼠骨髓间充质干细胞的生长曲线，从而进一步了解其生长特性。通过流式细胞仪进行细胞鉴定。结果：原代培养显示24h后即可看到有少许细胞贴壁，刚贴壁的MSCs仍保持圆形，48h贴壁细胞增多，开始呈现成纤维细胞样形态，伸突，呈短梭形、三角或多角形。最初2~5天细胞增殖较慢，呈克隆样生长，细胞向四周伸展。第6~9天时细胞集落迅速增多，呈旋涡状，并向周围不断扩大，原代培养12~15天，细胞80~90％融合，即可以传代。一般情况下传至第4、5代可获得形态均一、增长旺盛的BMSCs纯化细胞。P2、P4、P6细胞生长曲线基本相同，分为潜伏期(第1~2天)、对数生长期(第3-5天)和平台期(第6~7天)，且几代细胞间生长状况稳定。取生长状态良好的第5代BMSCs，应用流式细胞仪进行表面抗原标志物鉴定的结果显示：CD90(98.9％)、CD29（93.7%）阳性，CD34(0.8％)、CD45(1.3％)阴性。结论：应用全骨髓培养结合贴壁分离法能够在体外简单、快速的分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，并使其在体外迅速得到增殖，且性状稳定。第二部分不同途径移植MSCs联合小间隙吻合法修复周围神经损伤的实验研究目的：设计在小间隙吻合法修复周围神经损伤的基础上，通过不同途径移植BMSCs，观察其对周围神经损伤的修复效果，寻找治疗周围神经损伤的有效治疗方法。方法：采用清洁级健康成年雄性SD大鼠36只，体重250g左右，经小间隙吻合法制成周围神经损伤修复模型后，随机分成3组，每组12只。对照组即小间隙吻合组（CG），实验组分为尾静脉移植BMSCs组（VG）和腓肠肌移植BMSCs组（GG）。各组大鼠左侧坐骨神经经锐刀切断后，均行小间隙吻合法修复（2.0mm神经小间隙）。对照组大鼠术后不做特殊处理。VG，GG术后一周移植BrdU阳性的第5代BMSCs。通过一般状态、光镜下大体形态、坐骨神经指数、运动神经传导速度、组织学和免疫组织化学、腓肠肌湿重恢复率、神经透射电镜的超微结构观察比较三组大鼠神经功能的恢复情况。结果：○1实验组大鼠术后足部溃疡发生率较对照组低，且肢体恢复自主活动的时间较对照组早；○2各组大鼠坐骨神经指数逐渐恢复，术后4周、8周、12周各组大鼠坐骨神经指数都有不同程度的恢复，4周时CG组与VG组、VG组与GG组差异具有统计学意义（p<0.05），CG组与GG组具有显著差异（p<0.01）；8周时CG组与VG组、CG组与GG组具有显著差异（p<0.01），VG组与GG组差异具有统计学意义（p<0.05）；12周时3组两两相比均有显著差异（p<0.01）；○3术后各组大鼠坐骨神经传导速度都有不同程度的恢复，GG组恢复程度较CG组、VG组好，VG组又优于CG组；4周、12周时3组两两相比均有显著差异（p<0.01）；○4术后4周、12周各组大鼠均可见到腓肠肌较对侧正常有萎缩，GG组萎缩程度较CG组与VG组轻，后两者腓肠肌萎缩程度相当。4周、12周CG组与VG组腓肠肌湿重恢复率差异无统计学意义（P=0.255,P=0.329）；4周、12周CG组与GG组，VG组与GG组差异均有统计学意义（P值均<0.05）；○5术后4周组织学和免疫组织化学检测显示：实验组大鼠神经纤维的排立、走形、分布较对照组好，其中GG组又较VG组好；实验组大鼠腓肠肌萎缩程度较对照组轻；实验组大鼠神经断端及伤侧脊髓前角可见BrdU阳性染色的干细胞，且局部雪旺细胞增生活跃；○6电镜下的超微结构，CG组髓鞘形状不规则，板层厚度较薄，部分可见脱髓鞘改变及轴突变性，雪旺细胞增生不明显。VG组髓鞘形状不规则，板层厚度较薄，未见神经纤维脱髓鞘性改变，雪旺细胞增生明显。GG组髓鞘呈圆形或椭圆形，形态规则，板层排立致密、较厚，无脱髓鞘改变及轴突变性。结论：1、通过静脉和肌肉两种途径移植的骨髓间充质干细胞能归巢至周围神经损伤部位；2、通过尾静脉和腓肠肌两种途径移植骨髓间充质干细胞均能促进神经的再生和功能的恢复，且腓肠肌途径优于尾静脉途径；3、通过腓肠肌途径移植骨髓间充质干细胞能够延缓失神经支配肌肉的萎缩。