[研究背景]胃癌是世界范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一,特别是在我国发病率明显高于欧美国家,严重危害人民健康,我国每年新发胃癌病例达40万人,死亡人数达30万人,胃癌高死亡率的原因主要在于早期胃癌通常没有特异的临床表现,大多数患者初诊时即属进展期胃癌甚至晚期胃癌,失去手术切除治愈的机会。目前对于胃癌的病因学认识是在环境致癌物包括生物因素如幽门螺杆菌(HP)感染等诸多外界因素影响下累积的遗传学和表观遗传学的改变,多基因和多个信号通路参与的疾病过程。因此鉴定胃癌发生发展相关新基因,为临床提供新的诊疗靶标并进行及早干预尤其具有现实意义。维生素D受体(Vitamin D Receptor, VDR)是转录因子核受体家族的成员。活化的维生素D与VDR结合后,VDR与另一种核受体RXR形成异二聚体,通过识别和结合靶基因调控序列中的特异性结合位点,即维生素D反应元件(vitamin D response elements。VDREs),来调控其下游靶基因的转录,产生一系列生物学效应,如抑制细胞增殖、促进细胞分化及凋亡、影响癌基因和调节免疫等；VDR不仅调节转录反应,还参与转录后microRNA的调节机制。在人类中,维生素D受体是由VDR基因编码的,是反式作用转录调控因子家族成员,与类固醇及甲状腺激素受体的序列相似。该受体的下游主要参与矿物质代谢、免疫应答和癌症等。VDR基因具有明显的多态性,到目前为止,至少有25个VDR多态性位点被发现,其中较多研究关于位于转录起始部位的Fok I酶切位点,其多态性可导致不同的翻译启动,使氨基酸序列长度发生改变,最终产生相同蛋白不同的变异体。已有研究证实VDR基因Fok I酶切位点多态性与前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤以及结直肠癌的发病相关。但鲜有VDR与胃癌发病相关性方面的研究,尚无明确的研究资料显示具有功能意义的Fok I酶切位点多态性与中国人胃癌发病、预后的相关性,对于VDR在胃癌发生发展中发挥作用的具体机制更属未知。我们的前期研究证实了VDR在胃癌组织中的表达低于其在胃正常组织中的表达；且胃癌组织中VDR的表达水平与胃腺癌细胞病理分化程度相关；VDR表达阳性者无疾病进展生存期和总生存期均较VDR阴性者延长。本课题进而从基因水平研究汉族人群维生素D受体基因Fok I酶切位点多态性与胃癌易感性的关系,及其对胃癌临床病理因素和生化指标的影响,以期为胃癌的临床诊治提供指导。我们还通过细胞实验进一步研究VDR在胃癌细胞增殖及侵袭中的作用。同时为了探究VDR调控胃癌发生发展的细胞内信号转导通路,我们通过TargetScan数据库分析得出wnt、β-catenin等癌基因有可能是VDR的潜在靶点。其中,β-catenin蛋白作为近年来新发现的一种信号蛋白,其在肿瘤发生发展中的作用正受到学术界的广泛关注,被认为参与并介导一系列肿瘤细胞增殖、抗凋亡、浸润转移等过程。Wnt信号通路则是一类广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中的高度保守的信号通路。在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中,具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变,导致信号异常活化,就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路是一组从细胞外通过细胞表面受体传递信号到细胞内的信号转导通路。具有三个分支：经典Wnt信号传导通路、非规范化的平面细胞极性的途径和非经典Wnt/钙通路。Wnt蛋白是分泌型的脂修饰信号糖蛋白,为Wnt信号通路细胞表面的跨膜受体Frizzled受体(FZD)的配体蛋白,当该配体蛋白Wnt与细胞膜表面的受体蛋白FZD结合后,胞内的Dishevelled蛋白(DVL)被激活。活化的DVL则可抑制APC、Axin以及GSK3 β等蛋白形成的复合物的功能,该复合物的主要功能是磷酸化细胞内游离的β-Catenin使之最终通过泛素化修饰而降解。所以该复合物降解功能受抑制使得细胞质中游离状态的β-Catenin蛋白大量积聚并进入细胞核,与TCF/LEF转录因子结合,启动下游靶基因(如c-myc、Cyclin D1等)的转录,从而导致了细胞增殖异常和肿瘤发生。以往的研究表明Wnt/β-catenin信号传导通路在良恶性乳腺肿瘤发生发展中均有重要作用。β-catenin在肿瘤细胞核和细胞质中的表达水平均升高,且其高表达与乳腺癌患者预后差有着密切的关系。有关乳腺癌转移的相关研究表明,Wnt参与了乳腺癌细胞的上皮-间质细胞转换(EMT)。降低Wnt/β-catenin信号可以阻止EMT的发生,从而抑制转移。Wnt信号通路不仅仅是乳腺癌发生发展的重要因子,同时参与了如大肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和几个其他类型恶性肿瘤的发生发展。Wnt配体蛋白的表达增加分别见于胶质母细胞瘤、食道癌和卵巢癌。结合Wnt通路在恶性肿瘤形成过程中的作用,我们有理由相信其为VDR在胃癌发生发展中发挥作用的可能机制之一,因此本研究进一步通过系统生物学研究手段,明确了VDR与Wnt/β-catenin信号传导通路的联系及VDR在胃癌演进过程中的功能机制问题,为后续研究提供线索,最终期望能为胃癌的早期诊断、判断预后及精准治疗等提供新的靶标。第一部分维生素D受体FokI基因多态性与胃癌易感性关系的病例对照研究[研究目的](1)明确汉族人群维生素D受体基因Fok I酶切位点多态性与胃癌易感性的关系。(2)探讨VDR基因Fok I酶切位点多态性对胃癌病理分化和生化指标的影响,为胃癌的早期诊断及预测预后提供指导。[研究方法]采用病例对照研究方法。山东省立医院2009年7月至2014年3月间收治的187例汉族胃癌患者为病例组,本院同期汉族健康体检者中随机选取212例为对照组。采用调查表的形式记录所有研究对象的临床基线资料,包括年龄、性别、体重指数、吸烟史、饮酒史、非甾体类药物服用频率、光照暴露时间、血脂、血钙、血C反应蛋白浓度、肿瘤家族史、肿瘤标志物、AJCC分期、组织学分型等,通过EXCEL电子表格建立数据库。采集所有研究对象清晨空腹肘正中静脉血标本和病例组胃癌患者的手术癌灶组织标本,提取组织及血液标本DNA,采用多聚酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP)方法测定维生素D受体基因Fok Ⅰ酶切位点多态性。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定胃癌患者及健康人群血清中的维生素D水平。计算并比较病例组和正常对照组的VDR Fok I酶切位点基因型及等位基因频率。采用SPSS 17.0软件进行数据处理。两组间计量资料的比较采用两样本t检验,两组间分类变量的比较采用卡方检验。Logistic多元回归分析校正混杂因素,计算优势比(odds ratio, OR)及其95%置信区间(95% Confidence Interval,95% CI),P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果](1) FF, Ff, ff 3种基因型分布频率在胃癌患者中分别为22.5%、51.9%、25.6%而在健康对照者中分别为32.1%、48.6%、19.3%。经检验两组中ⅤDR-Fok I酶切位点基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。(2)试验组和对照组间的年龄、性别、体重指数、吸烟史、酒精摄入量、非甾体类药物服用频率、光照暴露时间指标之间无统计学差异。携带f等位基因(Ff、 ff基因型)者在胃癌组和健康对照组中所占比例分别是77.5%和67.9%,f等位基因的出现频率在胃癌患者和健康对照者中分别是51.6%和43.6%,这两者在病例组和对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)。另外病例组中有肿瘤家族史者的比例明显高于对照组。(3)病理分化程度低分化、中分化、高分化者在携带f等位基因组(Ff、ff基因型)和不含f等位基因组(FF基因型)中的比例分别为33.3%、40.5%、26.2%和52.4%,34.5%,13.1%,这种差异具有统计学差异(P<0.05)。入院时CRP水平在Ff+ff基因型组较FF基因型组更高(5.5±2.4 mg/L和3.4±1.3mg/L,P<0.05)(4)血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、CEA、CA-125、尿酸和AJCC TNM分期(Ⅰ期到Ⅳ)及血清中的维生素D和钙的含量方面带或不带f等位基因的两组之间均无统计学差异(p>0.05)。[结论]本研究中我们发现VDR Fok I酶切位点基因多态性与中国汉族人群胃癌易感性相关。VDR Fok I f等位基因可能为胃癌患病的易感因素。携带f等位基因(Ff+ff基因型)的人群与不携带f等位基因的FF基因型人群相比,胃癌的患病风险增加了2.73倍。在NSAID的摄入量和光照暴露时间没有区别的情况下,病例组存在肿瘤家族史者的比例明显高于对照组,这表明Fok I基因多态性对胃癌患病的易感作用也可能受环境因素的影响。另外本研究表明,携带f等位基因的胃癌患者表现出较高的C一反应蛋白水平和更坏的病理组织分化,表明该类胃癌患者处于一个更严重的炎症状态且表现出更恶性的肿瘤行为,预示着其更差的预后可能。第二部分VI)R通过Wnt/ β-catenin信号通路调控胃癌发生发展的分子机制研究[研究目的](1)明确不同的VDR基因型及不同的VDR表达水平对胃癌细胞增殖、侵袭及转移能力的影响。(2)系统性的研究VDR在胃癌演进过程中的作用同Wnt/ β-catenin信号传导通路的关系。[研究方法](1)用RFLP-PCR检测不同胃癌细胞系的VD.R基因类型,用SDS-PAGE及Western蛋白印迹分析VDR在不同胃癌细胞系中的表达。(2)应用质粒转染及RNA干扰技术干预VDR在胃癌细胞系中的表达,通过与未干预的细胞系对照,用MTT法、克隆形成实验及Transwell实验检测VDR表达水平对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。(3)应用Lipofectamine2000将野生型及突变型VDR表达质粒转染至胃癌细胞,观察不同VDR基因型的胃癌细胞生物学行为的差异。(4)在不同胃癌细胞中,应用VDR的配体活性维生素D3刺激,或应用SiRNA及质粒转染干扰VDR表达后,用Western blot分析wnt信号通路关键蛋白β-catenin、wnt通路下游重要蛋白c-myc以及EMT重要靶标E-cadherin的表达情况,以明确VDR与Wnt/β-catenin信号传导通路的联系,及其在胃癌发生发展中的作用和机制。[结果](1)5种胃癌细胞系AGS、MGC803、N87、MKN-28及SGC7901的VDR基因均为野生纯合型,VDR在5种细胞系均有表达,N87相对于其它细胞株,VDR表达明显减低,而M28表达量最高。(2)用VDR质粒转染自然状态下VDR表达量最低的N87细胞系使其细胞VDR高表达后,能显著抑制细胞生长；相反,用VDR的SiRNA抑制该细胞表达VDR,则细胞生长快速。(3)克隆形成实验显示使N87细胞过表达VDR后,克隆很难形成,然而如果抑制VDR的表达,单个N87细胞快速生长形成克隆。(4)SiRNA干扰N87细胞VDR表达后,Transwell检测该细胞侵袭力显著增加,相反VDR过度表达的N87细胞失去了侵袭力。(5)用1,25(OH)2D3分别于0、2、5、10、30、60小时处理胃癌细胞系N87细胞,Western blot分析得出1,25(OH)2D3处理细胞后,VDR表达水平表现出呈时间依赖的表达增高,处理10h后表达量明显升高；且伴随着VDR表达量的增加,核内β-catenin蛋白表达量逐渐降低,而E-cadherin蛋白表达同样呈现出时间依赖的表达增高(p<0.05)。(6)转染野生型及FokI突变的VDR质粒至胃癌细胞系N87中,用1,25(OH)2D3分别于0、2、5、10、30、60小时处理野生及突变的细胞,均出现核内β-catenin与c-myc的表达下降,特别是在长时间(10h)刺激后,但胞质中E-cadherin的表达量却随刺激时间而增加。与转染野生型VDR Fok I的细胞相比,转染突变型的胃癌细胞内β-catenin的下降程度明显增强(p<0.05)。(7)转染VDR质粒及VDR的SiRNA至胃癌细胞系N87中发现：如果增加VDR的表达,β-catenin的表达量明显减少,同时细胞的增殖力明显减弱；相反,干扰VDR表达后β-catenin表达增加,同时细胞增殖力增强(p<0.05)。[结论](1)本研究的结果表明VDR在胃癌细胞恶性表型,如增殖能力、侵袭力、克隆形成等方面发挥了重要作用。(2)与转染野生型VDR的细胞相比,转染突变型的细胞内β-catenin的下降程度明显增强。说明Fok I突变的VDR能更好的通过调控wnt/β-catenin信号通路发挥抑癌作用。这与我们之前第一部分关于VDR多态性在胃癌患者中作用的研究结果相一致。(3)胃癌细胞受到活性维生素D刺激后,VDR会表达增加,核内同时β-catenin表达会相应降低,而E-cadherin会呈现出相应的增高,这就说明,当VDR被配体激活后,可通过一系列反应阻止β-catenin进入核内发挥作用,进而抑制了胃癌细胞的增殖,并通过影响E-cadherin调控了胃癌细胞的侵袭迁移。(4)增加胃癌细胞VDR的表达,β-catenin的表达量减少,同时细胞的增殖力明显减弱；相反,干扰VDR表达后β-catenin表达增加,同时细胞增殖力增强。进一步验证了VDR可通过调控β-catenin水平影响胃癌细胞的增殖等过程。