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研究背景与目的
多溴联苯醚(polybrominateddiphenylethers，PBDEs)是一种溴化阻燃剂(brominatedflameretardants，BFRs)，被广泛应用于家用电器、建筑材料、纺织物、汽车、飞机、聚氨酯泡沫、塑料等多种消费性产品中。PBDEs在环境中不易降解，并有生物累积效应，已成为环境污染物。目前主要是发展中国家在生产并使用PBDEs，而很多欧美发达国家已禁用。人群可通过室内粉尘吸入、饮食摄入等途径暴露，制造多溴联苯醚产品相关人员及婴幼儿的暴露水平最高。大量人类流行病学研究及动物实验表明，PBDEs有潜在的神经发育毒性作用。十溴联苯醚(decabromodiphenylether，PBDE-209)因热稳定性好，价格便宜，是最常用的一种PBDEs。PBDE-209对人体是否有危害仍存在不少争议，但多项动物和细胞实验证实十溴联苯醚可诱导神经发育毒性作用，然而关于抑制其毒性作用的研究甚少。
胰岛素样生长因子-I(Insulin-likegrowthfactor-1,IGF-Ⅰ)是一种神经营养因子，可调控神经的生长发育并减轻多种病理因素造成的神经损伤，从而修复神经功能。多项研究表明，IGF-Ⅰ主要通过激活PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路发挥生物学功能。本研究拟通过体内和体外实验探索IGF-Ⅰ是否抑制PBDE-209暴露诱导的神经发育毒性作用及是否通过PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路发挥作用，为抑制PBDE-209的神经发育毒性提供实验证据。
方法
1、体内实验
1.1将Sprague–Dawley(SD)雌雄大鼠以2∶1合笼受孕，再将孕鼠随机分为空白对照组、花生油组、PBDE-209组、PBDE-209+IGF-Ⅰ组，每组6只。空白对照组常规饲养，花生油组胃灌等量的精练花生油，PBDE-209组每日胃灌PBDE-209（300mg/㎏.d，溶于等量精练花生油），PBDE-209+IGF-Ⅰ组先胃灌PBDE-209，30min后再腹腔注射IGF-Ⅰ（20ug/kg.d），以上处理维持至孕21天。
1.2子鼠出生后常规饲养，28日断乳后在每组中随机选取雌雄子鼠各8只（每组共16只子鼠），实验分组为空白对照组、花生油组、PBDE-209组，PBDE-209+IGF-Ⅰ组，进行Morris水迷宫(Morriswatermaze，MWM)实验检测子鼠的空间学习和记忆能力。
2、体外实验
2.1选取出生24h内的新生鼠，解剖大脑取出海马组织，并体外培养海马神经干细胞（Neuralstemcells,NSCs）。
2.2培养7天后对海马神经干细胞进行鉴定和纯度测定。
2.3体外培养的海马神经干细胞分为7组：
1）空白对照组。
2）溶剂对照组：含1‰DMSO的培养液。
3）PBDE-209组：PBDE-209单独染毒。
4）PBDE-209+IGF-Ⅰ组：PBDE-209先作用30min，再加入IGF-Ⅰ。
5）PBDE-209+IGF-Ⅰ+LY294002组：先加入PBDE-209，再加入LY294002，30min后再加入IGF-Ⅰ。
6）PBDE-209+IGF-Ⅰ+PD98059组：先加入PBDE-209，再加入PD98059，30min后再加入IGF-Ⅰ。
7）PBDE-209+IGF-Ⅰ+LY294002+PD98059组：先加入PBDE-209，再加入LY294002和PD98059，30min后再加入IGF-Ⅰ。
PBDE-209、IGF-Ⅰ、LY294002、PD98059的浓度分别为：50ug/ml、120ng/ml、50umol/l、50umol/l。每组均设3个平行样本，实验重复3次。培养1h、24h、48h、72h、7d后，根据不同实验需求，选择相应培养时间的细胞以检测不同指标。
2.4通过细胞计数试剂盒-8（CellCountingKit-8，cck8）检测培养24h、48h、72h的新生鼠海马神经干细胞活力。
2.5用流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI法）检测培养24h的新生鼠海马神经干细胞凋亡率。
2.6通过细胞免疫荧光染色鉴定新生鼠海马神经干细胞，及检测诱导分化培养7d后海马神经元的百分率。
2.7通过蛋白质免疫印迹实验（Western-Blot，WB）检测培养1h海马神经干细胞的蛋白激酶B（proteinkinaseB，AKT），细胞外信号调节激酶1/2（extracellular-signalrelatedkinase1/2，ERK1/2）及其磷酸化蛋白水平，以GAPDH作为内参。
结果
1、体内实验：IGF-Ⅰ可改善孕期PBDE-209暴露诱导的空间学习和记忆能力下降
定向航行实验：PBDE-209组第3-5天的逃避潜伏期明显比空白对照组和花生油组长（P＜0.05），而花生油组与对照组差异没有统计学意义（P＞0.05），提示PBDE-209暴露可诱导子鼠的空间学习能力下降；PBDE-209+IGF-Ⅰ组子鼠的逃避潜伏期明显比PBDE-209组短（P＜0.05），提示IGF-Ⅰ可改善子鼠的空间学习能力下降。
空间探索实验：PBDE-209组子鼠游泳轨迹显示没有明确目的，主要围绕池边活动，而空白对照组和花生油组子鼠则主要活动于平台象限，子鼠有明显寻找平台倾向。PBDE-209组子鼠穿越平台次数和平台象限停留时间百分率明显低于空白对照组和花生油组（P＜0.05），而空白对照和花生油组间无明显差异（P＞0.05），提示PBDE-209组子鼠空间记忆能力受损。PBDE-209+IGF-Ⅰ组子鼠主要活动于平台象限，游泳轨迹提示有明显寻找平台倾向。PBDE-209+IGF-Ⅰ组穿越平台次数和平台象限停留时间百分率明显高于PBDE-209组，提示IGF-Ⅰ可提高子鼠的记忆能力。
综上IGF-Ⅰ可改善孕期PBDE-209暴露诱导的空间学习和记忆能力下降。
2、体外实验
2.1体外PBDE-209暴露抑制新生鼠海马神经干细胞的增殖和分化能力，并诱导凋亡通过CCK8法检测发现PBDE-209组的细胞活力下降，通过流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI法）检测发现PBDE-209组的细胞总凋亡率上升，通过细胞免疫荧光我们观察到PBDE-209可抑制新生鼠海马神经干细胞分化为神经元，而空白对照组和溶剂对照组以上三个指标均没有统计学差异。综上，体外PBDE-209暴露抑制新生鼠海马神经干细胞的增殖和分化能力，并诱导凋亡。
2.2IGF-Ⅰ抑制PBDE-209暴露诱导的新生鼠海马神经干细胞毒性作用
CCK8法检测发现PBDE-209+IGF-Ⅰ组细胞活力明显提高，流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI法）检测发现PBDE-209+IGF-Ⅰ组细胞总凋亡率下降，细胞免疫荧光法观察到PBDE-209+IGF-Ⅰ组海马神经元百分率增加。综上，IGF-Ⅰ可通过促进细胞的增殖、分化和抑制凋亡来抑制PBDE-209暴露诱导的海马神经干细胞毒性。
2.3IGF-Ⅰ通过激活PI3K/AKT和MEK/ERK通路抑制PBDE-209暴露诱导的新生鼠海马神经干细胞毒性作用
新生鼠海马神经干细胞加入LY294002和/或PD98059共培养后，CCK8法检测发现细胞的活力明显下降，流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI法）检测发现细胞凋亡率上升。细胞免疫荧光法观察到LY294002可抑制新生鼠海马神经干细胞分化为神经元，但加入PD98059却无明显变化。蛋白质免疫印迹实验结果显示，IGF-Ⅰ可上调P-AKT和P-ERK水平，并且上调作用可分别被LY294002和PD98059抑制。综上，IGF-Ⅰ通过激活PI3K/AKT和MEK/ERK通路促进新生鼠海马神经干细胞的增殖和抑制凋亡，可能主要通过PI3K/AKT通路来促进神经干细胞分化为神经元，从而抑制PBDE-209暴露诱导的细胞毒性作用。
结论
IGF-Ⅰ可通过促进海马神经干细胞增殖和分化，抑制细胞凋亡来抑制PBDE-209诱导的神经发育毒性，PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路参与其中。
多溴联苯醚(polybrominateddiphenylethers，PBDEs)是一种溴化阻燃剂(brominatedflameretardants，BFRs)，被广泛应用于家用电器、建筑材料、纺织物、汽车、飞机、聚氨酯泡沫、塑料等多种消费性产品中。PBDEs在环境中不易降解，并有生物累积效应，已成为环境污染物。目前主要是发展中国家在生产并使用PBDEs，而很多欧美发达国家已禁用。人群可通过室内粉尘吸入、饮食摄入等途径暴露，制造多溴联苯醚产品相关人员及婴幼儿的暴露水平最高。大量人类流行病学研究及动物实验表明，PBDEs有潜在的神经发育毒性作用。十溴联苯醚(decabromodiphenylether，PBDE-209)因热稳定性好，价格便宜，是最常用的一种PBDEs。PBDE-209对人体是否有危害仍存在不少争议，但多项动物和细胞实验证实十溴联苯醚可诱导神经发育毒性作用，然而关于抑制其毒性作用的研究甚少。
胰岛素样生长因子-I(Insulin-likegrowthfactor-1,IGF-Ⅰ)是一种神经营养因子，可调控神经的生长发育并减轻多种病理因素造成的神经损伤，从而修复神经功能。多项研究表明，IGF-Ⅰ主要通过激活PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路发挥生物学功能。本研究拟通过体内和体外实验探索IGF-Ⅰ是否抑制PBDE-209暴露诱导的神经发育毒性作用及是否通过PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路发挥作用，为抑制PBDE-209的神经发育毒性提供实验证据。
方法
1、体内实验
1.1将Sprague–Dawley(SD)雌雄大鼠以2∶1合笼受孕，再将孕鼠随机分为空白对照组、花生油组、PBDE-209组、PBDE-209+IGF-Ⅰ组，每组6只。空白对照组常规饲养，花生油组胃灌等量的精练花生油，PBDE-209组每日胃灌PBDE-209（300mg/㎏.d，溶于等量精练花生油），PBDE-209+IGF-Ⅰ组先胃灌PBDE-209，30min后再腹腔注射IGF-Ⅰ（20ug/kg.d），以上处理维持至孕21天。
1.2子鼠出生后常规饲养，28日断乳后在每组中随机选取雌雄子鼠各8只（每组共16只子鼠），实验分组为空白对照组、花生油组、PBDE-209组，PBDE-209+IGF-Ⅰ组，进行Morris水迷宫(Morriswatermaze，MWM)实验检测子鼠的空间学习和记忆能力。
2、体外实验
2.1选取出生24h内的新生鼠，解剖大脑取出海马组织，并体外培养海马神经干细胞（Neuralstemcells,NSCs）。
2.2培养7天后对海马神经干细胞进行鉴定和纯度测定。
2.3体外培养的海马神经干细胞分为7组：
1）空白对照组。
2）溶剂对照组：含1‰DMSO的培养液。
3）PBDE-209组：PBDE-209单独染毒。
4）PBDE-209+IGF-Ⅰ组：PBDE-209先作用30min，再加入IGF-Ⅰ。
5）PBDE-209+IGF-Ⅰ+LY294002组：先加入PBDE-209，再加入LY294002，30min后再加入IGF-Ⅰ。
6）PBDE-209+IGF-Ⅰ+PD98059组：先加入PBDE-209，再加入PD98059，30min后再加入IGF-Ⅰ。
7）PBDE-209+IGF-Ⅰ+LY294002+PD98059组：先加入PBDE-209，再加入LY294002和PD98059，30min后再加入IGF-Ⅰ。
PBDE-209、IGF-Ⅰ、LY294002、PD98059的浓度分别为：50ug/ml、120ng/ml、50umol/l、50umol/l。每组均设3个平行样本，实验重复3次。培养1h、24h、48h、72h、7d后，根据不同实验需求，选择相应培养时间的细胞以检测不同指标。
2.4通过细胞计数试剂盒-8（CellCountingKit-8，cck8）检测培养24h、48h、72h的新生鼠海马神经干细胞活力。
2.5用流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI法）检测培养24h的新生鼠海马神经干细胞凋亡率。
2.6通过细胞免疫荧光染色鉴定新生鼠海马神经干细胞，及检测诱导分化培养7d后海马神经元的百分率。
2.7通过蛋白质免疫印迹实验（Western-Blot，WB）检测培养1h海马神经干细胞的蛋白激酶B（proteinkinaseB，AKT），细胞外信号调节激酶1/2（extracellular-signalrelatedkinase1/2，ERK1/2）及其磷酸化蛋白水平，以GAPDH作为内参。
结果
1、体内实验：IGF-Ⅰ可改善孕期PBDE-209暴露诱导的空间学习和记忆能力下降
定向航行实验：PBDE-209组第3-5天的逃避潜伏期明显比空白对照组和花生油组长（P＜0.05），而花生油组与对照组差异没有统计学意义（P＞0.05），提示PBDE-209暴露可诱导子鼠的空间学习能力下降；PBDE-209+IGF-Ⅰ组子鼠的逃避潜伏期明显比PBDE-209组短（P＜0.05），提示IGF-Ⅰ可改善子鼠的空间学习能力下降。
空间探索实验：PBDE-209组子鼠游泳轨迹显示没有明确目的，主要围绕池边活动，而空白对照组和花生油组子鼠则主要活动于平台象限，子鼠有明显寻找平台倾向。PBDE-209组子鼠穿越平台次数和平台象限停留时间百分率明显低于空白对照组和花生油组（P＜0.05），而空白对照和花生油组间无明显差异（P＞0.05），提示PBDE-209组子鼠空间记忆能力受损。PBDE-209+IGF-Ⅰ组子鼠主要活动于平台象限，游泳轨迹提示有明显寻找平台倾向。PBDE-209+IGF-Ⅰ组穿越平台次数和平台象限停留时间百分率明显高于PBDE-209组，提示IGF-Ⅰ可提高子鼠的记忆能力。
综上IGF-Ⅰ可改善孕期PBDE-209暴露诱导的空间学习和记忆能力下降。
2、体外实验
2.1体外PBDE-209暴露抑制新生鼠海马神经干细胞的增殖和分化能力，并诱导凋亡通过CCK8法检测发现PBDE-209组的细胞活力下降，通过流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI法）检测发现PBDE-209组的细胞总凋亡率上升，通过细胞免疫荧光我们观察到PBDE-209可抑制新生鼠海马神经干细胞分化为神经元，而空白对照组和溶剂对照组以上三个指标均没有统计学差异。综上，体外PBDE-209暴露抑制新生鼠海马神经干细胞的增殖和分化能力，并诱导凋亡。
2.2IGF-Ⅰ抑制PBDE-209暴露诱导的新生鼠海马神经干细胞毒性作用
CCK8法检测发现PBDE-209+IGF-Ⅰ组细胞活力明显提高，流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI法）检测发现PBDE-209+IGF-Ⅰ组细胞总凋亡率下降，细胞免疫荧光法观察到PBDE-209+IGF-Ⅰ组海马神经元百分率增加。综上，IGF-Ⅰ可通过促进细胞的增殖、分化和抑制凋亡来抑制PBDE-209暴露诱导的海马神经干细胞毒性。
2.3IGF-Ⅰ通过激活PI3K/AKT和MEK/ERK通路抑制PBDE-209暴露诱导的新生鼠海马神经干细胞毒性作用
新生鼠海马神经干细胞加入LY294002和/或PD98059共培养后，CCK8法检测发现细胞的活力明显下降，流式细胞术（AnnexinV-FITC/PI法）检测发现细胞凋亡率上升。细胞免疫荧光法观察到LY294002可抑制新生鼠海马神经干细胞分化为神经元，但加入PD98059却无明显变化。蛋白质免疫印迹实验结果显示，IGF-Ⅰ可上调P-AKT和P-ERK水平，并且上调作用可分别被LY294002和PD98059抑制。综上，IGF-Ⅰ通过激活PI3K/AKT和MEK/ERK通路促进新生鼠海马神经干细胞的增殖和抑制凋亡，可能主要通过PI3K/AKT通路来促进神经干细胞分化为神经元，从而抑制PBDE-209暴露诱导的细胞毒性作用。
结论
IGF-Ⅰ可通过促进海马神经干细胞增殖和分化，抑制细胞凋亡来抑制PBDE-209诱导的神经发育毒性，PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路参与其中。