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研究目的: 探讨腺苷(Adenosine,ADO)诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其与Ca2+相关的机制。 材料和方法: HepG2细胞培养后按以下方法进行实验: ①CCK-8法检测细胞增殖活性:细胞传代至96孔板中,待细胞贴壁后分别用含不同浓度ADO(0-6.0mmol/L)的培养基处理HepG2细胞24h、36h及48h,然后利用CCK-8法测定ADO对HepG2细胞增殖活性的效应。 ②DAPI染色检测细胞凋亡:细胞传代至盖玻片上,待细胞贴壁后将HepG2细胞暴露于不同浓度的ADO(0-4.0mmol/L)作用24h,DAPI染色后在荧光显微镜下观察细胞核的形态学改变。 ③Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率:细胞贴壁后加入正常培养基(空白组和对照组)及ADO(处理组)作用细胞24h,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡情况。 ④Fura-2AM及Fluo-4AM检测细胞内游离Ca2+浓度:ADO处理组与正常对照组培养细胞24小时后,分别用荧光分光光度法检测Fura-2AM染色及共聚焦显微镜下检测Fluo-4AM染色,比较ADO处理前后细胞内钙离子浓度变化。 ⑤荧光定量PCR(RT-q PCR)检测相关因子mRNA表达:提取ADO(0-4.0mmol/L)作用24h后细胞总RNA,RT-qPCR法检测凋亡相关通路m-calpain,Caspase-4,Bax,Bak及Caspase-3的mRNA水平的表达; ⑥免疫印迹法检测蛋白表达:ADO(0-4.0mmol/L)处理HepG2细胞24h,提取细胞总蛋白,Western blot检测上述通路中相关蛋白的表达。 ⑦通过罗丹明123(Rho123)染色ADO处理前后的HepG2细胞利用流式细胞术检测ADO(0-4.0mmol/L)处理24h前后细胞线粒体膜电位(ΔΨm)变化。 结果: 1、观察不同浓度ADO分别处理HepG2细胞24h、36h及48h后对其细胞的增殖抑制作用:CCK-8法检测结果显示,随ADO浓度增加或作用时间延长,ADO处理组吸光值(OD值)减少,与对照组相比,差异有显著性(P<0.05),表明ADO抑制了肝癌HepG2细胞增殖。 2、不同浓度的ADO作用HepG2细胞24h后,荧光显微镜下观察DAPI染色后细胞核形态,正常细胞的细胞核呈圆形,淡蓝色;ADO处理后,染色质凝固、凝集,有典型的“凋亡小体”出现,这种凋亡特征的细胞呈剂量依赖性增加。 3、Annexin V-FITC/PI双荧光染色流式细胞术检测显示,随着ADO处理剂量的增加,细胞凋亡率逐渐升高,呈现出一定的剂量依赖性关系,表明ADO是通过诱导细胞凋亡抑制细胞增殖。 4、分别用荧光分光光度法及共聚焦显微镜观察细胞内钙离子浓度变化,结果表明不同浓度的ADO(0-4.0mmol/L)处理HepG2细胞24h后,Fura-2AM染色后显示细胞内游离钙离子浓度呈上升趋势(F340/F380比值升高,差异有显著性,P<0.05);Fluo-4AM染色后于共聚焦显微镜下可检测到细胞内荧光强度明显升高。 5、RT-qPCR和Western blot检测结果显示,与对照组相比,不同浓度的ADO(1.0-4.0mmol/L)处理HepG2细胞24h后,细胞内钙依赖蛋白m-calpain、内质网相关蛋白Caspase-4、Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax、Bak及凋亡执行蛋白Caspase-3表达上升;与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。 6、流式细胞术检测线粒体膜电位(ΔΨm)结果表明,与对照组相比,随着ADO浓度增加,ΔΨm显著下降(P<0.05)。 结论: 1、ADO能抑制人肝癌HepG2细胞增殖并诱导其凋亡。 2、在此过程中,ADO可提高细胞内游离Ca2+水平,激活钙依赖蛋白m-calpain,Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax、Bak,Caspase-4及Caspase-3,并伴有线粒体膜电位降低。钙稳态失衡后活化的内质网应激途径及线粒体通路参与了ADO诱导的肝癌细胞凋亡。