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N-糖基化修饰是真核生物最为常见的翻译后修饰之一，其对蛋白质的分泌、活性、功能和结构稳定性有重要影响。而课题组前期将来自Penicilliumpurpurogenum Li-3菌中的β-葡萄糖醛酸苷酶在毕赤酵母中重组表达后发现其发生了糖基化修饰，而经糖基化修饰后的β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-P）的热稳定性与野生型相比得到明显提高。因此，本论文针对N-糖基化修饰对PGUS-P稳定性的影响展开研究，在PGUS-P模拟结构基础上，设计了新的N-糖基化修饰位点，以期获得稳定性提高的β-葡萄糖醛酸苷酶。主要研究结果如下：首先以毕赤酵母重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-P）为研究对象，采用半理性设计方法对其进行糖基改性，通过定点突变在PGUS-P中引入具有EAS（enhancedaromatic sequence）序列的新N-糖基化位点。通过活性筛选和糖蛋白筛选，最终得到三个成功引入新糖基化修饰的突变酶PGUS-P-26，PGUS-P-35和PGUS-P-259。其次，对PGUS-P-26，PGUS-P-35和PGUS-P-259的酶学性质和催化特性进行了分析，结果表明：三个突变酶的最适温度均由50℃提高到55℃，但最适pH未发生变化。稳定性分析结果表明：引入糖基化修饰后PGUS-P-35和PGUS-P-259的热稳定性均得到改善，在65℃下保温90min时，PGUS-P-35和PGUS-P-259的剩余酶活力分别维持在95%和93%，而PGUS-P在65℃下保温相同时间后剩余酶活为84%左右。糖基化修饰并未对三株突变酶的pH稳定性造成明显变化。反应动力学常数测定表明，PGUS-P-35的最大反应速度由111.25μmol/Lmin-1提高为120.48μmol/Lmin-1，并且引入糖基化修饰后，PGUS-P-26，PGUS-P-35和PGUS-P-259催化甘草酸的Km变小，Kcat/Km增加，表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。最后对突变酶的结构稳定性进行分析，荧光光谱分析表明三个突变酶的荧光峰均发生红移，表明荧光发射基团（Try）的微环境极性增加，糖基化修饰后蛋白质三级结构发生变化，其中以PGUS-P-35的偏移最大。而对氨基酸变化前后结构的模拟比对分析结果表明，只有PGUS-P-26的氨基酸突变导致了酶蛋白的空间结构发生了微弱的变化，而PGUS-P-35和PGUS-P-259的空间结构均未发生变化，因此，进一步说明了突变酶稳定性的改变是由于糖基化糖链的添加导致的。