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随着经济的发展以及化石燃料等不可再生资源的持续消耗,可再生资源的开采和利用受到了越来越多的关注。木质纤维素是地球上储量最为丰富的可再生资源,木质纤维素降解可以采用酸水解和酶水解两条不同的技术路线来实现,同酸水解相比,酶水解具有反应条件温和、不生成有毒降解产物、糖得率高和设备投资低等优点。对纤维素生物质的酶解需要纤维素酶,包括内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4),纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和p-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21),三类酶组分的协同作用。丝状真菌是主要的纤维素酶生产菌,对木质纤维素的降解发挥着非常重要的作用,由此看来,对真菌纤维素酶的酶系组成以及调控机制的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。里氏木霉能产生大量的纤维素酶,但其p-葡萄糖苷酶的产量很低,从而限制了其纤维素酶的降解效率。因而,p-葡萄糖苷酶被认为是一种限速酶。p-葡萄糖苷酶在酶系混合物中发挥着重要角色。它能将纤维寡聚体或者纤维二糖降解成葡萄糖,既可影响它们对纤维素酶合成的诱导,也可缓解纤维二糖对纤维素酶作用的抑制。由此可见,p-葡萄糖苷酶作为木质纤维素降解酶系的重要组分,对其它酶组分的合成和作用有一定的调控作用。与里氏木霉相比,本实验室从土壤中筛选到的草酸青霉114-2的纤维素酶酶系更加完全,表现出独特的优越性。通过生物信息学的方法,预测草酸青霉114-2中有11个可能的p-葡萄糖苷酶基因,其中有5个属于胞外酶。采用双向差异凝胶电泳技术(DIGE)对胞外分泌蛋白进行分析,却只能检测到胞外主要的p-葡萄糖苷酶BGL1蛋白点,胞外其他四种p-葡萄糖苷酶并不能检测到。而这种现象在丝状真菌中是普遍存在的。像里氏木霉和黑曲霉的基因组中也有多个p-葡萄糖苷酶编码基因,但通过DIGE技术同样也只能检测到一个BGL蛋白点。那些表达量低的胞外β-葡萄糖苷酶根本检测不到。基于以上研究背景,本文对草酸青霉114-2中5种胞外β-葡萄糖苷酶的生物学功能进行比较研究,分析他们之间的异同,试图寻找新的功能基因,找到高比活力的p-葡萄糖苷酶,来为提高纤维素生物质的降解效率、构建高产纤维素酶菌株提供基础。本论文的主要研究进展如下：1.5种胞外β-葡萄糖苷酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的异源表达根据草酸青霉114-2基因组序列,设计了五种bgl基因的全长引物;根据pPIC9K载体上的多克隆位点,在引物两端分别加上合适的酶切位点,以草酸青霉114-2cDNA为模板,扩增了全长的bgl基因。将扩增好的目的片段分别与pPIC9K连接,构建出重组质粒pPIC9K-bgls。之后通过电转的方法转入毕赤酵母GS115,在组氨酸营养缺陷型培养基中进行转化子的筛选。通过甲醇诱导的方式使外源蛋白分泌表达。SDS-PAGE的结果表明,5种β-葡萄糖苷酶都成功得到了表达,但表观分子量都略大于理论分子量。以水杨苷为底物对粗发酵液进行酶活测定,发现rBGL4的酶活最高。rBGL3虽然蛋白浓度最高,但并不能检测到酶活,猜测bgl3可能不是一个真正的β-葡萄糖苷酶基因。2.重组蛋白的分离纯化及其酶学性质的研究利用HisTrapTMFF对重组蛋白rBGLs进行分离纯化,对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE分析,结果显示五种重组蛋白都得到了单一的目的蛋白。当以水杨苷为底物时,纯化后的β-葡萄糖苷酶的比活力分别为rBGL1=168.9U/mg, rBGL3=0, rBGL4=331.4U/mg, rBGL5=130.0U/mg,rBGL6=96.9U/mg。出乎意料的是,尽管本源BGL4的表达量很低,但异源表达的rBGL4的酶学性质要显著优于本源表达量最高的rBGL1。在底物特异性研究实验中选择了芳香族糖苷和糖类物质两类底物。在芳香族糖苷中,5种重组蛋白对七叶苷底物的水解活力最高；在多糖类糖苷中,rBGL1和rBGL4对龙胆二糖的水解活性最高,rBGL5对纤维二糖的水解活力最强,rBGL6对槐糖的水解活力最强。不管以哪种物质作为底物,rBGL4的比活力都要远远高于其他几种重组酶。通过HPLC的方法检测重组酶对纤维寡糖的水解能力,结果显示rBGL1和rBGL4对纤维寡糖的水解能力较高,最终的产物只有G2和G1,但rBGL5和rBGL6对纤维寡糖的水解能力较差,最终的产物是G1-G6的混合物。rBGL4的最适温度为80℃,远高于rBGL1的60℃;rBGL4在80℃下保温2h,仍能保持最大酶活的94%,而rBGL1在60℃下保温2h,只能保持最大酶活的75%,且当温度升高至70℃时立即失活。用内切糖苷酶H(Endo H)对五种重组酶进行处理后,分子量都接近于理论分子量,说明各酶组分均被不同程度的N-糖基化修饰。对去N-糖基化前后重组酶的活性及稳定性的比较发现,去N-糖基化后,rBGL4和rBGL6的活性下降,rBGL5的活性升高,对rBGL1的活性影响很小；去N-糖基化后,rBGL1、rBGL4和rBGL6的稳定性很好,rBGL5的稳定性依然很差。3.重组的β-葡萄糖苷酶对高产菌株JU-A10-T发酵液糖化能力的影响高产菌株JU-A10-T在高产酶培养基中发酵5d后收集粗酶液并测定其FPA和β-葡萄糖苷酶活力,向粗酶液中分别添加rBGL1、rBGL4和rBGL5使混合后的酶液中FPA:BGL分别为1：1和1：2。当以脱木素木糖渣或未脱木素木糖渣为底物时,混合酶液的糖化能力相较于原始粗酶液均有所提高,且β-葡萄糖苷酶的比例越高,糖化能力越强。当以脱木素木糖渣为底物时,糖化效果更好,添加rBGL1或rBGL4使FPA:BGL=1:2糖化36h后,糖化液中葡萄糖的浓度较对照组分别提高了46%和44%。