中国香菇LeV-HKB和LePV1的多重RT-PCR快速检测体系建立及其脱除技术研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:miaoym
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
香菇(Lentinulaedodes(Berk.)Pegler)是世界上栽培范围最广的食用菌之一。香菇病毒是香菇生产上较重要的一类潜在隐患。我们在前期的研究中发现,中国香菇种质资源中主要携带有2种病毒,分别为L.edodespartitivirus1(LePV1)和L.edodesmycovirusHKB(LeV-HKB),这2种病毒能单一或复合感染香菇。本研究进一步以单重RT-PCR为基础,通过对反应条件和参数的摸索与优化,建立了同时检测这2种病毒的半定量多重快速检测体系;此外,采用化学脱毒和菌丝碎片脱毒对这2种主要病毒进行病毒脱除研究,建立了适合于这2种主要病毒的脱除技术,并对脱毒前后菌株基本生物学特性进行了初步分析。取得的主要研究结果如下:  (1)香菇主要病毒LeV-HKB和LePV1半定量多重RT-PCR检测体系建立:以LeV-HKB、LePV1病毒单重RT-PCR检测技术为基础,加入香菇β-actin基因作为内参,对单重和多重RT-PCR检测体系中RNA提取技术,反转录体系中RNA浓度,cDNA浓度、PCR体系中引物浓度、dNTP浓度、退火温度和循环次数进行筛选优化。建立了以STE法为RNA提取方式,反转录体系中RNA浓度为50ng/μL,cDNA浓度为0.5-25ng/μL,20μLPCR体系中引物浓度和dNTP浓度为0.25μmol/L,退火温度为57.4℃,循环次数为35,能同时检测LeV-HKB病毒和LePV1病毒,并能通过比较病毒与β-actinPCR产物的亮度初步了解菌丝体内病毒的含量的半定量多重RT-PCR检测体系。对两种病毒的PCR产物进行了克隆和测序,扩增基因片段与登记的病毒序列同源性99%以上,并利用建立的半定量多重RT-PCR检测技术对香菇核心种质进行检测,结合我们此前的报道,结果一致。所建立的半定量多重RT-PCR技术具有特异性高、灵敏度好、适用性强的特点。  (2)化学药剂和物理方法(菌丝碎片)对香菇主要病毒LeV-HKB和LePV1的脱毒作用研究:以单独携带和复合感染有LeV-HKB和LePV1的8个香菇菌株为材料,分别用0.75μg/mL的放线菌酮处理8个周期,经半定量多重RT-PCR检测,结果表明放线菌酮对LeV-HKB和LePV1病毒无明显的效果;进一步对处理前后的菌株采用qRT-PCR检测病毒表达量变化。研究结果表明,与处理前菌株病毒表达量相比,采用放线菌酮处理8个周期后的绝大多数菌株LeV-HKB和LePV1病毒表达量均下调。以单独携带和复合感染有LeV-HKB和LePV1的10个香菇菌株为材料,分别用100μg/mL病毒唑处理8个周期。半定量多重RT-PCR检测发现,病毒唑能有效地脱除部分供试菌株携带的LeV-HKB,而不能脱除LePV1。进一步采用qRT-PCR对不能脱除LeV-HKB和LePV1的供试菌株检测发现,与脱毒前相比,大多数菌株采用100μg/mL病毒唑处理8个周期后能显著降低病毒表达量。对单独携带和复合感染LeV-HKB和LePV1病毒的6个香菇菌株进行菌丝碎片脱毒处理,结果表明,采用菌丝碎片法能有效脱除部分供试菌株LeV-HKB和LePV1,但脱除效率还有待进一步提升。  (3)对供试菌株病毒脱除前后的菌丝生长速度进行了比较分析,结果表明所有脱除了病毒菌株的菌丝生长速度均快于出发菌株,且绝大多数菌丝生长速度显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)快于出发菌株。  该项研究为从源头(菌种)控制香菇病毒病害发生和追踪类似病毒病害的发生、流行监控等方面奠定重要理论和技术基础。
其他文献
油菜平作和垄作密度试验杨传学,张广军,王金辉,董永强(黑龙江省二龙山农场)随着油菜生产的发展,油菜菌核病越来越重,严重威胁着油菜的发展。据调查油菜菌核病与种植密度关系密切,密度
重播节目应注意时间概念电台、电视台开设重播节目,满足了那些漏听、漏看的听众和观众的要求,可是在重播节目时,应注意时间概念。如9月6日上午某电视台电影频道播出了一部反映中国
类胡萝卜素是一类共轭的类异戊二烯分子,在自然界中种类繁多,结构多样,是一类天然的色素分子。类胡萝卜素在生物体内承担着一系列的生物学功能,包括保护膜结构、进行光合作用
近20年来,随着设施蔬菜栽培在我国的迅速发展,番茄根结线虫的发生区域不断扩大(如在辽宁省沈阳市郊区露地已发生北方根结线虫病),危害日趋严重,其产量损失达30%~50%,严重的50%以
期刊
本实验对来自山西忻州的一些表现病毒病症状的白草、高粱和玉米材料(共15个样品)采用生物学,血清学和分子生物学等方法和技术进行了检测和序列的分析、比对。 利用多种植
目的:探讨下肢骨折内固定术后膝关节功能障碍的早期综合康复治疗的疗效.方法:选取我院2017年1月—2017年12月期间收治的下肢骨折后膝关节功能障碍患者50例,对照组采用常规康
目的:探讨研究在血液透析患者中预防高血压护理中,循证护理方法产生的应用效果.方法:将我院2017年3月至2017年6月收治的40例血液透析高血压患者纳入本次研究对象,采取患者自
目的:评估不同程度慢性肝病患者的凝血参数,探讨其在临床实践中作为肝细胞损伤标志物的诊断价值.方法:将30名健康体检者和70例临床确诊的肝脏疾病患者纳入研究,并根据血清学
目的:探究分析数字视频脑电图在儿科重症监护室临床应用效果及其潜在的临床应用价值.方法:我院2017年2月-2017年12月入住我院接受治疗的儿科重症监护室患者,随机选取50例,25