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肾细胞癌是泌尿系统肿瘤中最致命的恶性肿瘤。肿瘤浸润和转移是造成病人死亡的主要原因之一，但其转移的确切机制目前尚不十分明确。肿瘤血管生成与肿瘤生长、浸润、转移及预后关系的研究已成为对实体肿瘤研究的热点问题之一。研究表明，肾癌发生侵袭转移是一个多环节、多步骤的动态过程，涉及癌细胞的黏附、降解、移动和血管生成等多发事件。 类表皮生长因子域7(Egfl7)的研究涉及血管形成过程中成管这一关键性的步骤。由内皮细胞及其原始细胞分泌产生，Egfl7因子被血管内皮细胞分泌后停留在其附近，表明其可能跟细胞外基质相关，介导细胞间相互作用。 RNA干扰(RNAi)是近年发现的生物进化上的一种防御机制，其机制是一些小的与靶基因同源互补的双链RNA，特异性降解靶mRNA，在mRNA水平特异性抑制相应基因的表达，从而使其基因表达沉默、相应功能表型缺失，是一种序列特异性的转录后基因沉默现象。自从RNAi技术诞生以来，作为基因沉默的一种新技术不仅在基因功能分析、病毒学研究领域获得较大进展。 我们采用免疫组化、Western-bolt检测Egfl7在肾癌组织和细胞中的表达，通过构建全长的逆转录病毒SiRNA-Egfl7质粒，干预沉默人肾癌细胞株786-0细胞Egfl7的表达，研究对肾癌细胞生物学行为的影响，通过裸鼠成瘤、血管成管模型，验证Egfl7调控新生血管成管的作用导致肿瘤生物学行为的改变。旨在阐明Egfl7在肾癌新生血管生成的重要作用，为肾癌复发转移的诊断和治疗提供新的靶点。 目的： 1、探讨Egfl7在肾细胞癌组织的表达及意义; 2、构建靶向沉默Egfl7的表达对肾细胞癌侵袭转移和血管生成的作用机制。 方法： 1、采用免疫组化的方法检测82例肾细胞癌组织中Egfl7蛋白的表达，结合临床病理资料分析，研究Egfl7的表达与临床病理特征及微血管密度(MVD)的关系。 2、通过构建全长的逆转录病毒pSUPER-Egfl7-siRNA质粒，通过鉴定后，将其稳定转染到PT67细胞培养，获得分泌Egfl7蛋白病毒血清，干预沉默人肾癌细胞株786-0和人微血管内皮细胞系(HMEC-1)中Egfl7的表达，体外采用划痕实验、Transwell侵袭实验、血管成管实验、MTT、流式细胞仪检测和裸鼠成瘤实验等方法，研究Egfl7调控肾癌细胞分化增殖、侵袭、运动和肾细胞癌血管成管的分子机制，验证Egfl7通过调控肾细胞癌血管成管的作用导致肿瘤生物学行为的改变。 结果： 1、Egfl7在肾细胞癌中的表达 Egfl7蛋白阳性表达为棕黄色或棕褐色颗粒，绝大多数位于细胞浆内。82例临床肾癌标本中，Egfl7阴性25例，阳性57例，阳性表达率为69.5％。采用Mann-Whitney U检验分析Egfl7蛋白与RCC的临床病理特征的关系， Egfl7表达与患者年龄、性别之间差别无统计学意义，与肿瘤分期(P=0.002)、分级(P=0.022)有关，且染色强度随着cTNM分期和Fuhrman核分级的升高而增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 2、Egfl7在肾癌细胞株的表达水平检测 Western-blot方法检测了Egfl7蛋白在肾癌细胞株786-0及肺癌A549细胞株中的表达，结果显示:Egfl7蛋白在肿瘤细胞中存在高表达，且和HUVEC细胞表达无显著性差异(P=0.324)，此结果提示Egfl7作为一种分泌蛋白，可能由肾癌细胞分泌，参与调控血管内皮细胞的迁移运动和血管生成等肿瘤生物学作用。 3、Egfl7与MVD的关系 Egfl7表达阴性的组织MVD值为79.4±27.2，显著低于Egfl7表达阳性的组织MVD值127.3±31.3(P=0.001)。且MVD和Egfl7的表达呈正相关(r=0.875，P=0.003)。 4、逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默人肾癌细胞株786-0中Egfl7的表达 人肾癌细胞株786-0细胞Egfl7RNAi+中Egfl7的表达被明显抑制，较对照组而言，其抑制效率超过70％(P＜0.05)，而作为对照的人肾癌细胞株786-0细胞Egfl7RNAi-中Egfl7的表达无明显变化。以上结果提示本研究中采用逆转录病毒介导的小RNA干扰能够有效特异的沉默人肾癌细胞株786-0细胞中Egfl7的表达。 5、体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制肾癌细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡 肾癌细胞株786-0细胞Egfl7RNAi+较肾癌细胞株786-0细胞Egfl7RNAi-细胞迁移能力明显下降，24小时划痕愈合率分别为62％ vs77％，差异具有显著性意义(P＜0.05)。用Transwell侵袭小室测定法比较两者的侵袭能力，结果显示肾癌细胞株786-0细胞Egfl7RNAi+较肾癌细胞株786-0细胞Egfl7RNAi-细胞侵袭能力明显下降，24小时培养后穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为63±11 vs129±13，差异具有显著性意义(P＜0.05)。用MTT法比较肾癌细胞株786-0细胞Egfl7RNAi+较肾癌细胞株786-0细胞Egfl7RNAi-的增殖能力，结果显示两组细胞增殖能力差异不具有显著性意义(P＞0.05);进而采用AnnexinⅤ和PI双染法结合流式细胞仪技术检测凋亡情况，结果显示两组细胞的凋亡差异不具有显著性意义(P＞0.05)。这些结果提示在体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制抑制肾癌细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡。 6、体内抑制Egfl7的表达可以抑制肾癌细胞的成瘤能力 比较MiceEgfl7RNAi+和Mice Egfl7RNAi-两组裸鼠模型中原发瘤的大小，结果显示皮下种植45天后原发瘤的大小(cm3)分别为3.01±0.22和3.45±0.23，差异具有显著性意义(P＜0.05)，比较MiceEgfl7RNAi+和Mice Egfl7RNAi-两组裸鼠模型原发瘤中的MVD，结果显示MiceEgfl7RNAi+和Mice Egfl7RNAi-两组平均MVD值分别为29±2和37±3，差异具有显著性意义(P＜0.05)，这提示体内抑制Egfl7的表达能够抑制肾癌的生长可能与抑制肿瘤血管生成有关。 7、逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默HMEC-1人微血管内皮细胞中的Egfl7的表达 人微血管内皮细胞HMEC-1Egfl7RNAi+中Egfl7的表达被明显抑制，而作为对照的人微血管内皮细胞HMEC-1Egfl7RNAi-中Egfl7的表达无明显变化。以上结果提示本研究中采用逆转录病毒介导的小RNA干扰能够有效特异的沉默人微血管内皮细胞HMEC-1中Egfl7的表达。 8、体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成 HMEC-1 Egfl7RNAi+内皮细胞不能在Matrigel上形成网状结构;对照组管腔数为22.67±2.52，实验组管腔数为7.67±0.58，两组差异具有显著性意义(P＜0.05)。三维血管新生模型对照组和实验组中每10个微载体成管数分别为45±9和9±7，差异具有显著性意义(P＜0.05)，这些结果说明体外抑制Egfl7的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成。 结论： 1、Egfl7在肾细胞癌中的高表达可能参与了肾细胞癌的发生、发展。 2、Egfl7可能通过调控血管成管作用参与了肾细胞癌的侵袭转移。 3、Egfl7可能成为抗肾细胞癌侵袭转移和血管生成的基因治疗新靶点。