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目的急性肾损伤（AKI）是临床常见的急危重症,是严重危害人类健康的公共卫生问题。目前尚缺乏特异、有效的治疗策略。间充质干细胞（MSCs）来源的外泌体（MSC-exos）由于携带天然的有效治疗成分,作为一种无细胞疗法可能成为具有良好前景的AKI治疗新手段,但其治疗机制仍未完全阐明。本研究主要探讨:（1）MSC-exos在缺血再灌注（I/R）诱导的AKI（I/R-AKI）动物模型中的生物分布及疗效;（2）MSC-exos内容物促进肾小管修复的作用机制;（3）中空纤维管生物反应器三维（3D）培养对MSC-exos产量和疗效的影响。通过本研究,为理解MSC-exos治疗AKI的新机制及促进其临床转化提供新的实验和理论依据。本研究包括三个部分:第一部分:人脐带间充质干细胞源外泌体对缺血性AKI的治疗作用方法:体外培养人脐带间充质干细胞（huc MSCs）,经表面标志物、成骨、成脂和成软骨鉴定后,使用P6代以内细胞的无血清培养上清提取MSC-exos。通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白免疫印迹（western blot）表征MSC-exos。应用IVIS小动物活体成像系统对I/R-AKI小鼠中MSC-exos的生物分布进行成像,通过抗体封闭、si RNA等技术证明MSC-exos归巢至损伤肾脏的可能机制。最后,观察MSC-exos对I/R-AKI小鼠的治疗效果。结果:Huc MSCs为梭形成纤维样细胞,高表达CD29、CD44、CD73和CD90（阳性率>97%）,不表达CD34和CD45（阳性率<1%）;且可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。MSC-exos为中位粒径约134 nm的双层膜囊泡。体外成像显示,MSC-exos可有效地归巢到I/R损伤的肾脏,其机制主要是通过MSC-exos表面的整合素VLA-4和LFA-1与损伤肾小管表达的VCAM-1和ICAM-1相互作用。此外,MSC-exos以剂量依赖的方式减轻小鼠缺血性AKI,减少肾小管损伤及间质炎症细胞浸润。结论:MSC-exos可有效地归巢至I/R损伤的肾脏,并定位于近端小管。其机制主要是由MSC-exos的整合素VLA-4、LFA-1与损伤肾小管的VCAM-1、ICAM-1结合所介导。MSC-exos可剂量依赖性地减轻I/R-AKI的肾脏损伤、促进肾小管修复。第二部分:MSC-exos修复缺血性AKI的机制探讨方法:采用免疫荧光染色观察Ki-67+、p-H3+的小管上皮细胞（TECs）数量,评估各组G2/M期细胞比例;采用缺氧/复氧（H/R）构建细胞模型;采用CCK-8和Brdu增殖实验观察TECs的增殖情况;采用TUNEL染色和流式细胞术检测TECs凋亡情况;高通量测序对MSC-exos的miRNA进行分析,并采用q RT-PCR验证。将关键miRNA inhibitor转染至MSCs,构建关键miRNA敲降的MSCs;提取MSC-exos干预I/R-AKI小鼠模型,用于验证该关键miRNA是否参与了MSC-exos介导的小管修复。结果:MSC-exos在体内和体外均能显著抑制TECs的细胞周期G2/M阻滞、促进小管增殖并可减少TECs的凋亡。进一步对机制进行深入研究发现,miR-125b-5p在MSC-exos中高度富集,MSC-exos可将miR-125b-5p递送至TECs,从而抑制p53的表达,引起其下游CDK1和Cyclin B1上调挽救G2/M阻滞,并导致下游Bcl-2上调和Bax下调以抑制TECs凋亡。上调p53可削弱MSC-exos的作用;抑制miR-125b-5p可减弱MSC-exos对I/R-AKI小鼠的治疗作用。结论:MSC-exos可以促进缺血性AKI的肾小管修复,其机制是通过miR-125b-5p/p53途径改善TECs的G2/M期阻滞、促进增殖和减少凋亡。本研究为MSC-exos在肾小管修复中的作用提供了新视角,并强调了MSC-exos作为AKI治疗策略的潜力。第三部分:3D培养对MSC-exos产量的影响及其对AKI的疗效评价方法:从人脐带中分离出huc MSCs,并在培养瓶中进行2D培养。将2×10~8个MSCs接种至中空纤维生物反应器中进行3D培养。每隔1～2天收集培养上清,分离外泌体;采用TEM、NTA和外泌体标志物来表征2D和3D培养的外泌体（2D-exos、3D-exos）;通过蛋白定量比较2×10~8个MSCs在2D和3D培养体系中的外泌体产量。采用顺铂诱导的AKI小鼠模型和顺铂诱导的TECs损伤模型探究2D-exos和3D-exos的治疗效果及可能机制。结果:与传统的2D培养相比,3D培养未改变MSCs的表面标志;3D-exos的形态、大小和外泌体标志物与2D-exos一致。与2D培养相比,3D系统的总外泌体产量为2D的19.4倍。3D培养上清液中外泌体的浓度是2D上清液的15.5倍,因此提高了超速离心法提取外泌体的效率。疗效方面,2D-exos和3D-exos均能显著改善顺铂诱导的AKI,表现为保护肾功能、减轻肾小管病理损伤、减少炎症因子表达、抑制T细胞和巨噬细胞浸润等;但3D-exos比2D-exos治疗效果更佳。体外实验表明,顺铂损伤的TECs对3D-exos的摄取率更高,且3D-exos的抗炎和提高TECs活力的作用更优。结论:本研究建立了一种基于中空纤维生物反应器3D培养系统生产MSC-exos的新方法,该系统可连续、高效地生产MSC-exos。与传统的2D培养相比,3D培养能够产生更多的外泌体,并显著提高外泌体收集效率。同时,与2D-exos相比,3D-exos在治疗顺铂诱导的AKI方面具有更优效果和抗炎作用。全文总结及主要创新点:本研究通过构建I/R-AKI模型,探讨了MSC-exos在I/R-AKI中的生物分布及治疗作用,并探讨了其修复肾小管的作用机制;通过建立中空纤维生物反应器3D系统连续、高效收获上清提取3D-exos,并探讨了3D-exos与2D-exos对顺铂诱导AKI的疗效差异。主要创新点如下:（1）发现MSC-exos有归巢于损伤肾脏的作用,并主要定位于近端小管,其机制可能是由MSC-exos表达的整合素VLA-4、LFA-1与损伤肾小管的VCAM-1、ICAM-1结合介导。（2）阐明MSC-exos可显著抑制TECs的细胞周期G2/M阻滞和凋亡,此与MSC-exos富含miR-125b-5p,并可将miR-125b-5p递送至TECs,通过下调p53减轻TECs的G2/M期阻滞、促进增殖、减少凋亡有关。（3）发现与传统的2D培养相比,3D培养系统可连续、高效地生产3D-exos,且其在改善顺铂诱导的AKI方面具有更优疗效。