研究背景子宫内膜异位症(内异症)是一种激素依赖性的女性常见疾病,发病率逐年上升,病因迄今不明。越来越多的证据表明,内异症是一种表观遗传学疾病,DNA甲基化是最重要的表观遗传调控方式之一,DNA甲基转移酶(DNMT)在DNA甲基化过程起主要调控作用。HOXA10基因内异症易感基因之一,一种重要的转录因子,其异常甲基化模式与内异症生物学行为和预后相关。妊娠期饮食能对子代基因组产生长期影响,叶酸是人体中必需的维生素,参与人体新陈代谢的全过程,是合成人体DNA的必需维生素,并与细胞分化、倍增及其功能密切相关,对人类孕育生命影响重大。叶酸作为人体内甲基基团的最终来源,在维持DNA甲基化中起着重要的作用。临床研究及动物实验已证实母体叶酸缺乏或代谢异常与胚胎发育异常密切相关,孕前和孕期补充叶酸可预防或减少子代出生缺陷的发病率。但内异症作为表观遗传疾病,内异症孕妇与正常孕妇未予叶酸干预其女性子代内异症易感基因HOXA10甲基化是否存在差异及内异症孕妇服用叶酸是否影响子代内异症易感基因HOXA10的甲基化状态,目前尚未见相关研究报导。目的本研究旨在比较内异症孕妇与正常孕妇未予叶酸干预的情况下,其女性子代内异症易感基因HOXA10异常甲基化率是否存在差异,并且通过比较内异症孕妇补充叶酸是否影响女性子代内异症易感基因HOXA10异常甲基化水平,了解叶酸在优化宫内环境的作用,为如何预防“成人疾病胎儿起源”提供线索。方法1.标本来源：新生儿脐带血标本来自2010年至2012年南方医科大学珠江医院妇产科和惠州市中心医院妇产科,新生儿为女性者入选本研究,内异症患者均经孕前手术病理诊断或剖宫产术后病理诊断,孕妇孕前及孕期有无服用叶酸属于回顾性的分析。内异症孕妇新生儿脐血标本36例,其中有21例自孕前至早孕3月服用叶酸0.4mg/d,15例孕前和孕期未服用叶酸,无内异症孕妇儿脐血标本56例,其中有30例孕妇自孕前至早孕3月服用叶酸0.4mg/d,另26例孕妇孕前及孕期未服用叶酸。分娩时用柠檬酸钠抗凝管采集新生儿脐血2ml,置于-20℃低温冰箱保存。2.实验方法：(1)细胞DNA磁珠提取试剂盒提取血液标本基因组DNA；(2)DNA亚硫酸氢盐处理；(3)利用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)及亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP)分别检测子代内异症易感基因HOXA10启动区5′CpG的甲基化状态。3.统计分析：采用SPSS13.0软件进行统计学分析,各组间率的比较采用x2检验和Fisher精确概率(样本总数小于40或理论频数小于5)检验。检验水准a=0.05。结果1.甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)：甲基化特异性PCR检测各组子代内异症易感基因HOXA10的甲基化状态,其中内异症未服叶酸组有6例新生儿脐血检测到甲基化,发生甲基化率为40%(6/15),正常未服叶酸组检测到1例发生甲基化,发生甲基化率为3.8%(1/26),两组比较差异有统计学意义(x2=8.782,P=0.006)；内异症孕妇中服用叶酸组有1例新生儿脐血检测到甲基化,发生甲基化率4.7%(1/21),内异症未服叶酸组有6例新生儿脐血检测到甲基化,发生甲基化率为40%(6/15),两组甲基化率比较差异有统计学意义(x2=6.937,P=0.013)。正常组服用叶酸检出甲基化率为3.3%(1/30),与正常未服用叶酸组甲基化率的比较差异无统计学意义(χ2=O.011,P=1.0)。2.亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP)：亚硫酸氢盐修饰后测序四组子代内异症易感基因HOXA10的甲基化状态,其中内异症未服用叶酸组有7例新生儿脐血检测到甲基化,发生甲基化率为46.6%(7/15),正常未服叶酸组检测到1例发生甲基化3.8%(1/26),两组比较差异有统计学意义(χ2=11.106,P=0.002)；内异症孕妇中服用叶酸组有1例新生儿脐血检测到甲基化,发生甲基化率为4.7%(1/21),未服用叶酸组有7例新生儿检测到甲基化,发生甲基化率为46.6%(7/15),两组甲基化率比较差异有统计学意义(χ2=8.890,P=0.005)。正常组服用叶酸检出甲基化率为3.3%(1/30),与正常组未服用叶酸甲基化率的比较差异无统计学意义(χ2=0.011,P=1.0)。讨论近年随着一系列临床研究的不断深入,遗传学因素在内异症发病中的贡献不断得到证实。内异症患者的一级女性亲属罹患内异症的风险较非患病亲属显著增高。目前研究通过对内异症病灶的染色体和基因分析,证实HOXA10等多个位点基因启动子区CpG岛的存在高甲基化,并认为HOXA10异常甲基化导致的HOXA10基因表达下降可能是内异症发病机制之一。在动物模型中越来越多的证据表明,已经观察到对胎儿时期重编程产生影响的许多因素是受表观遗传所介导的。文献有报道表观遗传修饰虽然不能改变DNA序列,但可遗传至子代的。目前对其具有家族聚集性的研究主要集中在流行病学调查,目前尚无动物或人体实验研究证实。本实验从内异症的表观遗传角度,利用甲基化特异性PCR法和亚硫酸盐测序法检测发现,在无叶酸干预的情况下,相对于正常孕妇的女性子代,内异症孕妇其女性子代的内异症易感基因HOXA10异常甲基化率显著增加。进一步提示内异症可能是一种具有家族聚集性的表观遗传学疾病。叶酸在基因的调控所需的甲基化过程中起重要的作用,人体无法合成叶酸,必须靠外源性供给,且妊娠期妇女的叶酸需求量增多,叶酸不足的情况严重,叶酸在体内的主要功能是提供甲基供体参与DNA合成,它在调节包括细胞内甲基化反应和保持基因组稳定性方面具有重要的作用。近年来的研究认为DNA甲基化与人类多种肿瘤的发生有关,DNMT作为甲基化的关键酶在肿瘤的发生过程中起重要作用,DNMT活性异常增高是抑癌基因高甲基化进而表达失活的主要原因。有研究显示,叶酸可影响DNMT的活性,导致肿瘤的发生,DNMT在多种肿瘤和细胞中呈现高活性。有研究中发现补充叶酸后能抑制肿瘤病灶细胞的DNMT的活性,使其mRNA和蛋白表达下降。在王金桃等的实验中发现叶酸可抑制DNMT1的表达和活性,从而使得抑癌基因P16高甲基化水平降低,进而影响相关基因P16的表达。这些都进一步叶酸状态与体内DNMT的活性和表达水平有关,说明体内叶酸的水平可影响DNMT的活性和表达,从而影响DNA的甲基化水平。然而这种现象同样在子宫内膜的DNMTs得到证实,在Ding YB等的研究中发现在正常假孕小鼠胚胎种植时子宫内膜DNMTs在正常水平,而给予低叶酸饮食的假孕小鼠内膜的DNMT1、 DNMT3A和DNMT3B均升高,这也说明叶酸可以影响子宫内膜DNMTs的水平。同样Wu等研究结果发现异位内膜中3种甲基转移酶(DNMT1, ANMT3A和DNMT3B)基因均过度表达,内异症患者中存在DNA的异常甲基化。在人体受试者中发现,胎盘是母体血浆叶酸传输给胎儿的决定性因素,叶酸通过胎盘的叶酸受体传输,在胎儿血液中叶酸甚至是母体叶酸水平的几倍。内异症作为表观遗传性疾病,补充叶酸能否预防内异症这类女性成人疾病的发生?在Sie KK等的实验中发现孕鼠在孕期补充叶酸的,其子代DNA甲基化显著降低,并且子代的大肠癌发生几率下降了64%,说明叶酸能够影响大鼠的宫内环境而降低其子代患大肠癌的风险。因此,针对这一胚胎甲基化重塑时期,我们的实验中研究内异症孕妇孕前及孕期补充与未补充叶酸,其女性子代内异症易感基因HOXA10异常甲基化的比较,在利用甲基化特异性PCR检测到前者的异常甲基化率为4.7%,而后者为40%；两者甲基化率比较差异有统计学意义(P<0.05),利用亚硫酸盐测序法检测到前者的异常甲基化率为4.7%,而后者为46.6%；两者甲基化率比较差异有统计学意义(P<0.05)；而正常组服用与未服用叶酸两组的甲基化率无统计学差异。分析原因可能为补充叶酸后通过抑制DNMT的活性和表达,继而使得内异症易感基因HOXA10的甲基化水平降低。因此在妊娠早期纠正异常的甲基化状态对于预防女性内异症成人类疾病可能具有深远的意义。结论1.孕妇无叶酸干预的情况下,内异症的孕妇其女性子代内异症易感基因HOXA10甲基化率较正常孕妇女性子代显著升高,进一步提示内异症可能是一种具有家族聚集性的表观遗传学疾病。2.内异症孕妇于孕早期补充叶酸后,其女性子代内异症易感基因HOXA10甲基化率显著降低,提示叶酸在预防胎源性子宫内膜异位症易感基因HOXA10异常甲基化中可能起一定作用。