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第一部分ASIC1a在人胃癌组织中的表达及其与胃癌的临床病例特征研究目的:研究ASIC1a在人体胃癌组织及其相应癌旁组织中的表达差异,探讨ASIC1a与人胃癌的关系及临床意义。方法:应用荧光定量PCR、免疫组织化学及Western Blot方法检测ASIC1a在32例胃癌、相应的癌旁组织中的表达,统计分析两者与胃癌临床病理特征的关系。结果:Real-time RT-PCR检测结果分析显示:ASIC1a基因在胃癌组织的相对表达量为0.052±0.011,癌旁组织为0.006±0.0003,差异有统计学意义(P<0.05)。Western-Blot检测结果同样显示胃癌组织ASIC1a基因表达高于癌旁组织,差异显著(P<0.05)。ASIC1a蛋白的过表达与肿瘤直径、肿瘤浸润深度,有无淋巴结转移,TNM分期,神经侵犯,血清CEA,血清CA724等有关(P<0.05)。结论:ASIC1a在胃癌中高表达,可能发挥了一定的致癌作用。第二部分ASICs在胃癌细胞株AGS中的表达及其抑制剂Ami,PcTx1对其干预作用研究目的:研究ASICs在AGS胃癌细胞株中的表达及其相关调控。方法:以AGS胃癌细胞为研究对象,通过单细胞膜片钳技术,Real-time PCR和免疫印迹技术,分析ASICs在AGS胃癌细胞上的转录与表达水平的变化,并分析ASICs非特异性抑制剂阿米洛利(Ami)以及ASIC1a特异性拮抗剂狼蛛毒素(PcTx1)对ASICs通道功能的调控作用。结果:在AGS胃癌细胞上存在有ASICs的表达。其中Ami和ASIC1a特异性拮抗剂PcTx1能阻断AGS细胞由酸诱发的电流,并存在浓度依赖性。结论:在AGS胃癌细胞中,存在有ASICs的表达,酸诱导后能产生电流,Ami及PcTx1能阻断电流。第三部分调节ASIC1a基因表达对胃癌细胞侵袭与转移的影响目的:研究ASIC1a与胃癌细胞侵袭与转移的关系及作用机制方法:利用慢病毒载体在AGS细胞系中转染减低ASIC1a表达的siASIC1a干扰质粒,从而构建稳定细胞系,经Western-Blot,qRT-PCR验证敲减ASIC1a基因对细胞的增值的影响;敲减ASIC1a基因在不同的PH值的微环境中对细胞增值的影响,划痕实验和Transwell研究细胞迁移、侵袭能力变化。细胞接种于裸鼠皮下成瘤模型,研究转染前后细胞成瘤能力变化。结果:ASIC1a基因敲减后,体外能明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭;该影响受细胞微环境中PH的影响,体内能改变癌细胞成瘤能力。ASIC1a基因具有致癌作用。结论:胃癌细胞ASIC1a的敲减能降低胃癌的侵袭与转移的能力。第四部分 ASIC1a蛋白通过激活自噬信号通路介导胃癌细胞侵袭与转移的机制研究目的:探讨ASIC1a通过激活自噬信号通路介导胃癌细胞侵袭与转移。方法:以体外培养的人AGS胃癌细胞为研究对象,通过pH6.0酸性培养液诱导细胞损伤,通过单细胞膜片钳技术检测AGS细胞上的电流,免疫沉淀法检测自噬标志性蛋白LC3-II的表达及与ASIC1a蛋白的共定位情况。结果:单细胞膜片钳技术检测AGS细胞上有功能的电流产生,且可被ASIC1a的阻断剂阻断,免疫沉淀技术显示ASIC1a蛋白与LC3-II有共定位现象。结论:组织酸化等肿瘤诱发因素导致了胃癌细胞AGS细胞上ASIC1a的异常激活,并通过调节自噬信号通路的活性介导胃癌细胞侵袭与转移。