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肝纤维化(Hepatic fibrosis)是由各种致病因素所致的肝内结缔组织异常增生和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积的病理过程,可发展为肝硬化,甚至肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。引起肝纤维化的致病因素主要有慢性肝炎病毒(如HBV、HCV)、寄生虫(血吸虫)感染、酒精性肝病、脂肪性肝病、胆汁淤积、药物性肝损伤、自身免疫性肝炎等。若这些因素持续存在,可引起致纤维化细胞的产生与激活,其中主要是肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)的激活,此外还有门静脉周围的成纤维细胞、肝血窦内皮细胞和Kupffer细胞、骨髓来源的间充质干细胞、血液来源的纤维细胞以及发生上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)肝细胞或胆管上皮细胞等。这些细胞增生、激活,并转化为肌成纤维细胞(Myofibroblasts,MF),能够合成、分泌大量的ECM,导致肝纤维化和肝硬化。对肝纤维化发生机理的研究表明,许多与肝损伤有关的因素都可以导致HSC的激活,HSC的激活是肝纤维化发生的重要环节。各种病理因素引起肝实质细胞受损以及多种细胞生长因子的合成与释放,包括转化生长因子β(TGF-β)、上皮生长因子(EGF)、血小板衍化生长因子(PDGF)、内皮素(ET)、成纤维细胞生长因子(FGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、瘦素(leptin)等,激活TGF-β/Smad、Ras/ERK等信号通路,促进HSC的增殖和活化。HSC被激活后转化为肌成纤维细胞,表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA),并分泌ECM,包括胶原蛋白(CollagenⅠ、CollagenⅢ)及蛋白多糖等,导致ECM沉积,促进肝纤维化的发展。因此,通过抑制HSC活化来阻断肝纤维化的发展,是防治肝硬化的主要方向。现有的肝纤维化治疗模式主要包括两个方面,一是消除引起肝纤维化的致病因素,如抗病毒治疗、自身免疫性或酒精性肝病的糖皮质激素类治疗等;二是针对ECM沉积的治疗,减少其合成,增加其降解。目前可用于临床的抗肝纤维化治疗措施非常有限,因此研究新型的抗肝纤维化药物十分必要。苦参碱(Matrine,MT)是豆科苦参属苦参(S.flavescens Ait)的有效成分,具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤和抗肝纤维化的药理作用,对小鼠急性肝损伤和大鼠实验性肝纤维化有一定的预防保护作用。但MT药理作用不强、半衰期短、作用靶点尚不明确,对临床抗肝纤维化疗效不佳。本实验通过对新型MT衍生物进行细胞及动物实验研究,重点研究MD-1对肝纤维化HSC活化的影响及可能作用机制,为临床治疗肝纤维化提供候选治疗方案。在实验第一部分我们先对经过硫代和侧链迈克尔加成结构修饰后的三类新型硫代MT衍生物进行分析研究,筛选出具有强效作用的苦参碱硫代衍生物MD-1(C30N4H40SO5F),制成马来酸盐;比较MT与新型衍生物MD-1,研究其对大鼠肝星状细胞活化、迁移、细胞周期和凋亡等生物学行为的影响;实验第二部分运用体外细胞学方法,探求MD-1对HSC-T6细胞作用的可能靶点、参与的细胞因子及信号通路;实验第三部分构建二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导的肝纤维化大鼠模型,研究经MD-1干预后大鼠肝纤维化明显减轻的组织病理学证据。第一部分新型苦参碱衍生物对HSC-T6细胞生物学行为的影响苦参碱衍生物MD-1、MD-2、MD-3由于侧链基团的不同,其活性有极大的差别。MT及其衍生物在100 μM浓度下时,MD-1对HSC-T6细胞增殖活性的抑制作用最明显,细胞存活率下降到20%左右,IC50值为62μM。生物行为学实验发现MD-1有明显抑制HSC-T6细胞迁移的作用,通过对HSC-T6细胞G0/Gl期阻滞,起到促进HSC-T6细胞凋亡的特性,且MD-1作用均明显强于MT。第二部分新型苦参碱衍生物对HSC-T6细胞作用机制的研究制备生物素标记,通过免疫荧光观察到HSC-T6细胞上,MD-1与EGFR作用位点分布相一致的关系,然后再采用EGFR-shRNA表达载体敲减(knockdown)实验,通过HSC-T6细胞上的免疫荧光检测证实EGFR标记缺失时,其相应结合于细胞膜分布位置的MD-1免疫荧光强度也极大减弱,因而推断MD-1作用于HSC-T6细胞的靶分子是EGFR,MD-1可能通过结合EGFR发挥作用。本课题还进一步运用Westen-blot及qRT-PCR方法发现,MD-1处理后的HSC-T6细胞中,与细胞增殖、运动调控相关的EGFR、Akt分子的磷酸化水平显著下降,细胞周期调控蛋白CyclinD1表达下降,细胞凋亡相关蛋白p-Smad水平下降,与肝纤维化程度相关的α-SMA mRNA表达明显降低,细胞内Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ在mRNA水平的表达也明显减少,TIMP-1表达略有减少。此外,通过ELISA法检测发现细胞培养上清中CollagenⅠ蛋白的分泌量明显减少,由此结果推断HSC细胞的活化可被MD-1抑制,MD-1能够结合HSC-T6细胞膜表面的EGFR分子,抑制EGFR的磷酸化,EGFR下游蛋白激酶Akt的磷酸化过程受阻,与细胞增殖、迁移、周期、凋亡调控的靶分子蛋白Cyclin D1和与TGF-β信号通路调控相关的转录因子p-Smad表达下降,最终抑制HSC-T6活化,使之合成、分泌CollagenⅠ、CollagenⅢ等ECM的成分减少,发挥抗肝纤维化的生物学活性。第三部分苦参碱衍生物减轻DMN诱导的大鼠肝纤维化发生通过DMN成功诱导大鼠肝组织发生肝纤维化,染色后胶原纤维和肌纤维细胞增多,增生的胶原纤维分割包围假小叶,肝细胞出现点状坏死和淋巴细胞浸润。但经MD-1处理过的大鼠,病理切片肝组织胶原纤维增生明显比模型对照组轻,间隔纤细且呈不完全分割假小叶,肝细胞坏死不明显,MT组病理变化则介于模型对照组和MD-1组之间。免疫组化检测发现,MD-1组大鼠肝组织中p-EGFR、p-AKT、α-SMA、CyclinD1的表达低于模型对照组、高于正常对照组,MT组p-EGFR、p-AKT、α-SMA的表达下调低于模型对照组,CyclinD1、p-Smad与模型对照组相比下降不明显;通过对大鼠血液的ELISA检测显示,与模型对照组和MT组相比较,MD-1组血清中ALT、AST、CollagenⅠ含量明显降低,提示MD-1的干预处理可减缓大鼠肝纤维化的发生发展,保护肝实质细胞,改善肝功能。综上所述,新型苦参碱硫代衍生物MD-1可明显抑制HSC活性,诱导HSC凋亡,减少HSC分泌ECM,发挥抗肝纤维化的作用,有可能成为临床有用的抗肝纤维化候选药物。