论文部分内容阅读
在真核细胞内,内吞体分选转运复合体系统(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)由ESCRT-0、-I、-II、-Ⅲ与Vps4(vacuolar protein sorting 4)五个复合体及包括Alix在内的一些辅助因子组成。ESCRT系统具有膜剪切功能,在多泡体(Multivesicular bodies,MVBs)的形成、自噬、胞质分裂、质膜形成及核膜重构等生理过程发挥关键作用。此外,ESCRT系统也参与多种囊膜病毒的出芽释放过程。杆状病毒是一类大分子双链DNA囊膜病毒。在病毒感染周期中,杆状病毒产生两种类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子(Budded virions,BV)与包涵型病毒粒子(Occlusion-derived virions,ODV)。近期的研究发现,过表达宿主细胞ESCRT-Ⅲ组分或Vps4蛋白的显性-负性(Dominant-negative)突变体显著降低杆状病毒代表种苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的出芽释放,但其详尽的分子机理尚不明确。本论文中,我们构建了草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)ESCRT-Ⅲ复合体的6个亚基Vps2B、Vps20、Vps24、Snf7、Vps46、Vps60与Vps4及其突变体,以及ac11、ac76、ac78、ac80(gp41)、ac103、ac142、以及ac146等7个AcMNPV保守基因的瞬时表达质粒。在转染的草地贪夜蛾细胞Sf9中,双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)分析发现,ESCRT-Ⅲ复合体各亚基之间,以及这些亚基与Vps4之间存在相互作用。免疫共沉淀结合BiFC分析发现,参与AcMNPV BV出芽释放的7个保守病毒蛋白与宿主细胞ESCRT-Ⅲ亚基及Vps4之间存在不同程度的相互作用,其中Ac76、Ac78、GP41、Ac146蛋白与ESCRT-Ⅲ复合体的多数亚基(5-6个亚基)均能互作,而Ac103与Ac142则仅与2-3个ESCRT-Ⅲ亚基互作。此外,GP41与Ac103能够与Vps4或失活ATPase酶活的Vps4突变体互作,表明这两个病毒蛋白与Vps4的互作不依赖于Vps4的ATPase活性。基于上述相互作用结果,我们推测,通过这些相互作用,病毒蛋白与宿主ESCRT系统形成一个复杂的介导BV出芽释放的复合体。