胃癌是一种比较常见的消化道恶性肿瘤,我国的发病率较高,每年新发病例数约40万。胃癌死亡率高的主要原因是肿瘤的转移和复发。尽管手术技术及各种放疗和化疗技术的不断提高,但其预后仍不很理想,其死亡率仍占各类癌症死亡率中第二位,给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来越来越多的研究发现交感神经在肿瘤的发生和转移中起着重要作用。已知交感神经系统(SNS)通过释放递质去甲肾上腺素(NE)来调节神经、内分泌、心血管、消化、呼吸、生殖和免疫系统的基因表达和细胞功能。研究认为应激相关的精神心理压力可能是导致癌症发生的一个重要因素。β肾上腺能受体在食管癌、乳腺癌、鼻咽癌和结肠癌等癌细胞膜上高表达。如果交感神经侵入癌组织,其释放的大量NE可作用于β受体,继而通过β受体下游信号通路而影响癌细胞的行为,包括细胞增殖、凋亡、血管形成及癌细胞转移等。然而,有关交感神经对胃癌的影响,报道很少。我们推测交感神经系统与胃癌的进展、转移及预后有一定的关系,因此在这项研究中我们首先通过一些在线工具(如UALCAN、GEPIA和Timer等)筛选出胃癌组织中的高表达基因及其与胃癌预后的影响;继而收集了46例人胃腺癌根治术后的组织标本,对交感神经侵入胃癌组织作了形态学(交感神经分布)和功能(递质NE,β受体,受体后信号分子,以及胃癌恶化的可能效应分子)鉴定,并在癌组织水平研究了交感神经在胃癌组织中芽生和侵入的分子机制;进一步在胃癌细胞水平研究了异丙肾上腺素(ISO)对胃癌癌细胞增殖、迁移及浸润的影响及机制。第一部分生物信息学分析β肾上腺素能受体信号在胃癌组织中的表达、基因之间的相关性及对胃癌预后的影响目的:利用在线胃癌数据库筛选出胃癌组织中的高表达基因,探讨β肾上腺素能受体信号通路及相关基因与高表达基因之间的相关性及对胃癌预后的影响及其机制。方法:利用在线网络数据库(UALCAN、GEPIA和Timer等网站)进行TGCA数据库数据挖掘和分析。这些在线网络资源是资料相当全面的、用户使用简单方便的用于分析癌症组学的数据库,可以提供:A.方便访问癌症组学数据(TCGA MET500);B.提供癌症的生物标志物或验证某些潜在感兴趣的基因;C.提供基于基因表达的图表、两个或多个基因相关性分析及病人生存信息等。这些生物信息学分析可为下一步实验研究提供证据。采用Kaplan-Meier法分析基因表达与患者生存时间的关系;用Spearman相关分析评价两两基因间的相关性,计算Spearman秩相关系数(R),以便反映变量之间相关关系密切程度。结果:筛选出了胃癌患者的癌组织中前50个高表达基因;其中,CHI3L1(YKL-40)是第28位的高表达基因。在RNA水平上CHI3L1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01),尤其在胃癌分期中的Ⅰ期升高显著(P<0.01);神经生长因子(NGF)高表达组的胃癌患者的总生存率与低表达组相比明显下降(P=0.008);癌组织中巨噬细胞高度浸润的胃癌患者较低浸润患者的累计生存率明显降低(P=0.004);ADRB1和ADRB3的高表达组与低表达组比较对胃癌患者的生存率无统计学意义(P=0.72,P=0.63);ADRB2的高表达组显著降低胃癌患者的生存率(P=0.02);CHI3L1基因与ADRB1基因无明显相关性(Cor=-0.096,P=0.051),而CHI3L1基因与ADRB2或ADRB3基因相关性分析均有统计学差异,且存在正相关(P=0.00197,Cor=0.152,P=0.0346,Cor=0.104)。基因相关性分析结果:CHI3L1与STAT3正相关(R=0.48,P<0.001);CHI3L1与MAPK1正相关(R=0.41,P<0.001);CHI3L1与MAPK3正相关(R=0.35,P<0.001);CHI3L1与MMP9正相关(R=0.66,P<0.001);CHI3L1与SDC1正相关(R=0.37,P<0.001);同时也发现SDC1高表达组总生存率显著降低(P=0.031)。结论:β肾上腺能受体信号可能通过ERK/STAT3-YKL40促进胃癌的进展;MMP9和Syndecan-1是YKL-40的下游效应分子。第二部分交感神经侵入人胃癌组织的证据以及β肾上腺能受体信号通路促进胃癌进展的研究目的:在人胃癌组织水平上研究交感神经浸润癌组织的状况,交感神经递质NE的水平,以及β肾上腺能受体信号调节YKL-40的表达及下游效应分子MMP9和Syndecan-1等的表达变化及其促进胃癌进展的作用机制。方法:收集了46例行胃腺癌(STAD)根治术患者的手术切除标本,标本严格区分为癌组织(STAD)和癌旁组织(adjacent)两类。用免疫组化、HPLC和Western Blot等方法检测交感神经在胃癌组织和癌旁组织的分布、神经递质去甲肾上腺素(NE)水平、β受体(ADRB)及下游的一些信号分子的表达变化;同时用免疫组化和Western Blot检测CD206、CHI3L1、MMP9和Syndecan-1的表达变化。采用SPSS22.0软件进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差表示,两组间比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义的标准。结果:免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,交感神经(以酪氨酸羟化酶(TH)作为标志,S100作为神经髓鞘的标志)严重侵入胃癌组织中,交感神经纤维主要分布于癌巢之间的间质中,且离癌巢越近的部位交感神经分布密度越高。与交感神经芽生有关的NGF、生长相关蛋白43(GAP43),以及高亲和力NGF受体TrkA在癌巢的边缘或癌巢之间的间质也有高度表达。β2-肾上腺素能受体(β2-AR,ADRB2)在胃癌组织中高表达,且主要分布于癌细胞膜上;?3-AR在胃癌组织中也有一定程度的高表达,而?1-AR在胃癌组织中表达量很低,几乎为阴性。此外,YKL-40、CD206和MMP9均高度表达在癌巢之间的间质区;Syndecan-1和CD31主要表达在癌组织血管内皮上。Western blot结果显示,与癌旁组织相比,癌组织中的NGF、TrkA、ADRB2、GAP43、TH、S100、YKL-40、Syndecan-1、MMP9、CD206和CD31的表达均显著增加(P<0.005)。HPLC-ED检测发现,胃癌组织中的交感神经递质NE水平明显高于癌旁组织。结论:胃癌组织中的高水平NGF通过高亲和受体TrkA促进大量交感神经浸润;浸润的交感神经通过NE-β2-AR-YKL-40-MMP9/Syndecan-1通路促进胃癌的进展。第三部分在体外水平上研究β肾上腺能受体信号通路对胃癌细胞增殖、迁移和浸润的影响及机制目的:在细胞水平上阐明β-AR对胃癌细胞增殖、迁移和浸润的影响及其信号机制。方法:分别培养两种胃癌细胞系SGC-7901和AGS在六孔板中,每种细胞随机分成3组:对照组,异丙肾上腺素(ISO)组(10μmol/L ISO),ISO+ICI组(10μmol/L ISO和25μmol/L ICI118,551(β2-AR特异性阻滞剂))。加入ISO或ISO+ICI药物处理后处理后24 h后,用CCK8法检测两种细胞的增殖活性;用Transwell检测细胞的迁移和浸润能力,用Western Blot检测检测NGF、CHI3L1、MMP9、Syndecan-1、STAT3、pSTAT3、ERK、pERK的表达变化。采用SPSS22.0软件进行统计学分析,计量资料采用均数?标准差表示,两组间比较用t检验,三组间比较采用单因素方差分析;P<0.05为差异有统计学意义的判别标准。结果:与对照组相比,ISO组的两种胃癌细胞的增殖、迁移和浸润能力明显增加(P<0.05),且ISO组的NGF、CHI3L1、MMP9、Syndecan-1、pSTAT3和pERK表达均明显升高(P<0.05);ICI处理抑制了ISO的上述作用(ISO+ICI组)(与ISO组相比,P<0.05或P<0.01)。结论:β2-AR激动剂通过PKA-ERK/STAT3-YKL40信号通路促进两种胃癌细胞的增殖、迁移和浸润(转移),胃癌细胞产生的MMP9和Syndecan-1主要是通过降解基质和促进血管形成促进胃癌增殖和转移。研究总结1.由于癌组织中的NGF、TrkA和GAP43高表达,导致交感神经严重浸润人胃癌组织。2.侵入胃癌组织的交感神经通过释放其递质NE,激动癌细胞β2-AR及其下游信号通路PKA-ERK/STAT3,促进YKL-40的表达,后者促进MMP9和Syndecan-1的表达,最终促进胃癌的进展。因而NE-β2-AR-PKA-ERK/STAT3-YKL-40信号通路是交感神经浸润促进胃癌进展的主要机制,这一机制在胃癌细胞系上也得到了验证。3.我们首次用金标准HPLC-ED法测定胃癌组织中神经递质NE的水平。4.在胃癌细胞系上证明激动β2-AR可上调NGF的表达,而拮抗β2-AR后NGF的表达显著下调,同时癌细胞的增殖、迁移和浸润能力也被抑制,提示阻断交感神经和β2-AR信号通路可抑制胃癌的进展。5.交感神经浸润促进STAD进展的信号通路可能是:NE-β2-AR-PKA-ERK/STAT3-YKL-40-MMP9/syndecan-1