一、背景与目的细菌生物膜(bacterial biofilm, BBF)是指细菌附着于物体表面形成的高度组织化的多细胞结构,表面被覆由细菌自身产生的胞外多糖类聚合物并含有多种生物大分子物质如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等。与浮游菌相比,BBF对抗生素的耐药性以及对机体免疫清除作用的抵抗力均显著增强。同时,BBF能不断释放游离菌,造成感染的反复急性发作。常规剂量的抗生素虽可控制BBF释放出的浮游菌引起的感染,但却无法杀灭生物膜内部的细菌和清除生物膜。因此,目前普遍认为BBF是导致持续性感染和慢性炎症性疾病难以治愈的最常见原因。2004年,人们首次在慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis,CRS)患者体内发现BBF,此后类似的发现越来越多。现在普遍认为BBF是一些CRS患者病情严重且治疗效果差的主要原因。外科手术虽能有效清除BBF,但因肉眼无法辨别BBF累及黏膜的确切部位及范围,因此单靠手术常难以达到彻底清除BBF的目的。研究表明,大环内酯类药物对呼吸道黏膜BBF相关性疾病(包括鼻窦炎)具有一定疗效,但是应用这类药物进行治疗存在周期长、副反应明显、费用昂贵和患者依从性差等问题。因此,BBF相关性鼻窦炎的有效治疗是目前鼻科学领域需要重点解决的问题。借助于动物模型,可以更方便、深入地对这一问题进行研究,但是目前仅有的两种BBF相关性鼻窦炎动物模型均存在操作复杂、对动物鼻腔结构损伤较大等问题,限制了此类研究的深入开展。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)是人类常见致病菌,也是导致人类BBF相关性疾病的常见病原菌,如何针对S. aureus及其生物膜进行有效治疗已成为目前临床研究的热点。研究表明,S. aureus也是形成CRS患者鼻黏膜上BBF的最常见致病菌,其BBF被认为与鼻窦炎的难治性密切相关。一些专家特别指出,对于BBF相关性鼻窦炎治疗措施的研究以及治疗效果的评价应针对S. aureus形成的BBF。研究表明,纳米银对浮游菌及其生物膜均具有强大的杀灭作用,近年来纳米银产品在临床上的应用越来越多。目前纳米银产品的制备主要是通过化学还原的方法,过程复杂且常需添加有毒试剂作为化学反应的还原剂和纳米银颗粒的稳定剂。对于医药卫生领域中应用的纳米银产品,人们越来越多的关注于产品制备过程中的无毒、无害,即“绿色化学”。研究表明,与生物材料聚合既能减少纳米银颗粒的氧化、聚沉,又能增加其生物相容性,特别是一些天然生物大分子物质不但对金属有一定亲和力而且在合适的溶剂中是可溶的。作为天然生物大分子,丝素蛋白具有良好的生物相容性,能够促进细胞的生长和黏膜的修复,同时还能还原某些金属离子生成纳米金属颗粒而负载于丝素蛋白中。但是利用丝素蛋白制备纳米银并将其应用于生物医药领域的研究目前尚属空白。因此,本研究的目的：1.根据“绿色化学”的理念制备出丝素蛋白-纳米银(silkfibroin-nano silver, SF-NS)溶液。2.以S. aureus为目标菌种,观察SF-NS溶液的抗菌性能和抗BBF活性,探讨其潜在的临床应用价值。3.以S. aureus为致病菌建立BBF相关性鼻窦炎动物模型,通过体内实验观察SF-NS溶液局部冲洗对S. aureus生物膜相关性鼻窦炎的作用以及对鼻黏膜炎症的影响。二、材料与方法本课题分为四部分。第一部分：SF-NS溶液的制备和表征。利用丝素蛋白分子中酪氨酸的还原能力,在室温、光照条件下原位还原AgN03制备SF-NS溶液,并利用荧光光谱仪、紫外-可见分光光度仪(UV-visible spectrophotometer, UV-vis)和透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)等对反应过程和产物进行表征,明确丝素蛋白的还原能力、反应体系的动力学指标以及所形成纳米银颗粒的形貌学特征。第二部分：SF-NS溶液对S. aureus及其生物膜的作用。参照美国临床和实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的操作,采用肉汤稀释法对临床筛选的BBF阳性菌株和质控菌ATCC 29213进行最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)检测。然后,通过刚果红实验观察SF-NS溶液对S. aureus形成BBF的影响,再通过扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)和共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)观察SF-NS对成熟BBF的影响,明确不同浓度SF-NS对S. aureus及其生物膜的作用。第三部分：建立S. aureus生物膜相关性鼻窦炎动物模型。选取健康、体重2.5-3.5kg的新西兰大白兔45只,随机分为9组(其中4个模型组,4个阴性对照组,1个空白对照组),每组5只。模型组动物通过在右侧上颌窦前外侧壁钻孔并经此小孔向上颌窦内置入明胶海绵和BBF阳性菌菌悬液的方法造模；阴性对照组动物只进行右侧上颌窦前外侧壁钻孔并经此小孔向上颌窦内留置明胶海绵,但不植入菌悬液；空白对照组动物不进行任何处理。4个模型组和4个阴性对照组分别于术后1、2、4、8周时处死并采集上颌窦黏膜标本,空白对照组动物在整个实验结束时处死。通过HE染色和SEM观察造模后各时间点上颌窦黏膜的组织学特征和黏膜表面BBF的形成情况。第四部分：SF-NS溶液对S. aureus生物膜相关性鼻窦炎的作用。选取健康新西兰大白兔30只,体重2.5-3.5kg,随机分为5组,每组6只。A组：空白对照组,健康新西兰大白兔,不进行任何处理。B组：单纯造模组,建立BBF相关性鼻窦炎动物模型,不进行任何治疗。C组：生理盐水冲洗组,建立BBF相关性鼻窦炎动物模型,通过上颌窦置管用生理盐水冲洗上颌窦,每天2次,每次2mL,连续冲洗1周。D组和E组：SF-NS溶液冲洗组,建立BBF相关性鼻窦炎动物模型,通过上颌窦置管分别用2xMBC和5×MBC浓度SF-NS溶液冲洗上颌窦,每天2次,每次2mL,连续冲洗1周。通过HE染色、SEM、RT-PCR和Western-blot检测观察不同处理组动物上颌窦黏膜的组织学特点、BBF数量以及炎性因子表达水平的变化,探讨SF-NS溶液对S. aureus生物膜相关性鼻窦炎作用。所得实验数据用SPSS 16.0软件进行统计学处理。三、结果：第一部分1 荧光光谱仪检测结果显示,在1%的丝素蛋白溶液中,当AgN03浓度在0-8mg/mL范围内时,反应体系中的丝素蛋白对Ag+具有充足的还原能力。2 UV-vis检测结果表明在1%的丝素蛋白溶液中,当AgNO3浓度为4mg/mL时,在室温、光照条件下反应20h时反应体系达到了一个相对稳定的状态,并出现了纳米银颗粒的特征峰,进一步延长反应时间对纳米银的形成几乎没有影响。3 TEM检测显示,在以上反应体系中形成了粒径为12±2.1nm的纳米颗粒,高分辨率TEM检测表明所得产物为纳米银颗粒。4 通过以上反应形成的SF-NS溶液在室温下静置30天后(无论避光与否),溶液的颜色、性状和UV-vis检测曲线均未发生任何变化。第二部分1 无论是对于BBF阳性菌Sa006,还是质控菌ATCC29213, SF-N S的MIC和MBC均分别为19.8 mg/L和79.4mg/L。2 刚果红实验结果表明,1/4×MIC浓度的SF-NS能使Sa006形成的BBF明显减少；1/2×MIC浓度的SF-NS能完全抑制BBF的形成,但对Sa006的增殖无明显影响；MIC浓度的SF-NS能完全抑制Sa006的增殖。3 CLSM和SEM检测表明,MIC浓度的SF-NS对成熟BBF的结构以及其内部细菌的活力均无明显影响；随着SF-NS浓度的进一步增加,BBF的结构发生不同程度的破坏,当SF-NS的浓度为5×MBC时,生物膜结构被彻底破坏。第三部分1. 造模后模型组动物右侧前鼻孔均出现黄色脓涕,阴性对照组仅有8只出现少量清涕。在术后各时间点,模型组动物右侧上颌窦内均有脓性分泌物积存,对照组动物上颌窦内均无积脓。2.CT扫描显示,在造模后各时间点,所有模型组动物的右侧上颌窦内均充满软组织密度影,而阴性对照组动物仅在术后第1、2周时存在右侧上颌窦软组织密度影。正常对照组动物CT检测均未发现上颌窦内病变。3.HE染色结果显示,模型组动物上颌窦黏膜肿胀,黏膜层中出现大量炎性细胞浸润,而阴性对照组仅在术后1周和2周时有少量的炎性细胞浸润,术后4周和8周时黏膜的组织学特征基本恢复正常。4.SEM检测发现,在造模术后2、4、8周时,所有模型组动物的上颌窦黏膜表面均有BBF存在和不同程度的黏膜上皮损伤,而阴性对照组动物在术后各时间点黏膜上皮的完整性始终存在且均未发现BBF形成。第四部分1 SEM检测结果显示,A组上皮结构完整,纤毛排列整齐。B组与C组黏膜表面存在大量BBF,上皮结构破坏、纤毛结构缺失；D组黏膜表面仍存在少量的BBF,但上皮结构基本完整,部分上皮细胞表面有纤毛生长；E组黏膜表面未发现BBF,上皮结构完整,多数上皮细胞表面已经有新生纤毛形成。2 HE染色结果显示,A组表现为典型的假复层纤毛柱状上皮,黏膜层中无明显炎性细胞浸润；B组与C组上皮层明显破坏或缺失,黏膜层中大量炎性细胞浸润；D组上皮层虽然存在但细胞排列紊乱,黏膜层中仍有大量炎性细胞浸润；E组上皮层结构基本正常,但黏膜层中仍有较多的炎性细胞浸润。3 在RNA表达水平,与A组相比,B组IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α的表达显著增多,而IL-4、IL-5的表达显著减少。与B组相比：C组各炎性因子的表达均无明显变化；D组IL-1β的表达显著增多,而IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、TNF-α的表达无明显变化；E组IL-4、IL-5、IL-10的表达显著增多,IL-8的表达显著减少,IL-1β、TNF-α的表达无明显差异。与C相比：D组IL-1p的表达增加,IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、TNF-α的表达均无显著差异；E组IL-4、IL-5、IL-10的表达增加,IL-8的表达减少,IL-1β、TNF-α的表达无显著差异。4 在蛋白质表达水平,与A组相比,B组IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α的表达均显著增加。与B组相比：C组TNF-α的表达明显减少,IL-1β、IL-8、IL-10的表达均无明显差异；D组IL-1β的表达显著增多,TNF-α的表达明显减少,而IL-8、IL-10的表达均无明显差异；E组IL-8、TNF-α的表达显著减少,1L-1β、IL-10的表达无明显差异。与C组相比：D组IL-1β表达增加,IL-8、IL-10、TNF-α的表达无显著差异；E组IL-1β、IL-10的表达显著增加,IL-8、TNF-α的表达显著减少。四、结论：1 丝素蛋白能够在室温、光照条件下原位还原AgN03形成SF-NS溶液,所形成的纳米银粒径较为均匀,且能在常温下长期保持稳定。丝素蛋白在这一反应体系中不但起到了还原剂的作用,同时也起到了稳定剂的作用。2 SF-NS溶液对S. aureus具有良好的杀菌作用,并且在较低浓度时能抑制S. aureus生物膜的形成,在较高浓度时能够破坏成熟的BBF,效应呈浓度依赖性。3 以新西兰大白兔为模型动物,通过上颌窦前壁钻孔,在上颌窦内留置可吸收性明胶海绵并注入BBF阳性S. aureus的方法建立起的BBF相关性鼻窦炎动物模型,方法简单易行且结果可靠。4 S. aureus形成的BBF导致鼻黏膜发生了Th1/Th2双向失衡的炎症反应(Thl类炎性因子表达增多、Th2类炎性因子表达减少)。SF-NS溶液不但能彻底清除鼻黏膜上的BBF,而且能促进病变黏膜的组织修复和炎性因子表达的良性转归。