随着基因工程的发展,工业化生产的蛋白类制品越来越多,其市场前景也越来越广阔。利用外源蛋白表达系统生产具有重要价值的蛋白是现代生物技术产业的核心内容和研究热点,大肠杆菌作为当今世界上应用最广泛的蛋白质表达系统,有众多优点:大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉、待选质粒和宿主多,可以快速大规模地生产目的蛋白,而且其表达外源基因产物的水平远高于其它蛋白表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%。然而有些重组蛋白质制品特别是富含二硫键的蛋白质在大肠杆菌中表达常常为无活性的包涵体,具有生物活性蛋白质的获得需采用哺乳动物细胞表达系统,但哺乳细胞表达体系产率低、成本高、周期长、培养要求条件高等缺点严重限制了基因工程制品的推广应用。因此改善大肠杆菌表达系统使之可以应用于富含二硫键蛋白质的表达,是一个挑战性的课题。本课题选取具有工业化前景且富含二硫键的曲霉植酸酶作为研究目标,探索和改进其在大肠杆菌中的表达,通过基因操作将该基因分别连接4种不同的周质定位信号肽序列及利用两株具有氧化型胞质的大肠杆菌突变株来表达目的蛋白,以促进二硫键的形成,结果使植酸酶在原核表达中的活性大大提高;我们同时还对不同菌株的最佳表达条件进行了优化。主要结果如下:1.具有氧化型细胞质的工程菌株能够明显提高植酸酶的活性。构建植酸酶原核表达载体,利用两种氧化型突变大肠杆菌菌株作为宿主表达植酸酶,由于氧化型突变菌株的胞质环境及氧化状态的硫氧还蛋白家族类蛋白质有利于二硫键的形成,使植酸酶活性有明显提高,突变株Rosetta-gami(DE3)与一般普通表达菌株比,在一般诱导培养条件下植酸酶活性提高234%,另一株突变菌株TransB(DE3),其植酸酶活性也提高了220%。2.植酸酶周质定位有助于植酸酶活性的提高。实验中选取含有周质定位作用信号肽的质粒pET27b(含有信号肽序列SSPelB)作为表达载体,信号肽与目的蛋白的融合可以促进目的蛋白从细胞质转运到大肠杆菌的周质中,而周质不但具有与胞质不同的氧化环境而且包含促进二硫键形成的Dsb酶系统。为了筛选运转效率更高的信号肽,克隆得到了另外三种周质蛋白的信号肽序列即DsbA、DsbC及碱性磷酸酶的信号肽序列,分别命名为SSDsbA、SSDsbC和SSPhoA,用上述三种信号肽分别替代pET27b中原有的信号肽序列SSPelB,构建了三个新的表达载体。将植酸酶基因phyA分别插入这四个周质定位表达载体中,通过转化大肠杆菌获得了四株工程菌(SSPelB-PhyA、SSDsbA-PhyA、SSDsbC-PhyA、SSPhoA-PhyA)。与一般普通表达菌株比,四株具有周质定位的工程菌所产植酸酶活性均有大幅提高,活性分别提高164%、246%、225%、186%。3.最佳发酵条件的筛选。设置不同的培养温度、诱导剂浓度等条件,研究不同的发酵条件及组合对植酸酶表达量及酶活性的影响,通过30个不同的条件组合进行发酵优化。发酵结果显示,诱导剂浓度的改变对酶活性的影响比温度改变影响明显,0.25mM IPTG是大多数菌株的最佳诱导剂浓度;温度对植酸酶的表达及活性的影响较为复杂,不同工程菌株的最佳诱导温度介于25℃~37℃温度范围。4.发酵条件优化利于植酸酶活性的提高。经过各个菌株最佳发酵条件的优化,利用信号肽将植酸酶周质定位的菌株中SSDsbA-PhyA活性提高最为明显,在其最佳发酵条件28℃/0.25mM IPTG下相对于使植酸酶定位于还原型胞质可以使植酸酶催化活性提高525%;氧化型细胞质的菌株中PhyA-Rosetta-gami活性提高较大,在其最佳发酵条件34℃/0.50mM IPTG下相对于普通菌株可使植酸酶催化活性提高542%。