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目的使用组织块贴壁法,在体外分离、培养乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED),探讨杨梅素对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化能力的影响。以及在牙髓卟啉单胞菌脂多糖刺激下杨梅素对乳牙牙髓干细胞增殖能力及分泌IL-1β、IL-6的影响。方法1、使用组织块贴壁法进行原代细胞培养,取第3代细胞应用有限稀释法进行乳牙牙髓干细胞的分离,在倒置显微镜下观察乳牙牙髓干细胞的形态学特征,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD105、CD34、CD45的表达情况,免疫荧光检测角蛋白、波形蛋白的表达情况。2、分别用含100μmol/L、50μmol/L、20μmol/L、15μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、1μmol/L杨梅素的培养液对乳牙牙髓干细胞进行培养,分别于24 h、48 h、72 h时用MTS法检测OD值。实验组:用含1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L杨梅素的成骨诱导液对乳牙牙髓干细胞进行培养;对照组:用不含杨梅素的成骨诱导液对乳牙牙髓干细胞进行培养;分别于24 h、48 h、72h时检测乳牙牙髓干细胞碱磷酸酶活性。3、实验组:200mg/L LPS+DMEM培养基组;200mg/L LPS+20μmol/L杨梅素+DMEM培养基组;200mg/L LPS+100mg/L甲硝唑+DMEM培养基组;空白对照组:DMEM培养基;分别培养24 h、48 h、72 h后,用MTS法检测SHED的OD值。实验组:200mg/L LPS+DMEM培养液培养乳牙牙髓干细胞;20μmol/L杨梅素+200μg/ml牙髓卟啉单胞菌脂多糖培养液培养乳牙牙髓干细胞;阳性对照组:200μg/m L甲硝唑+200μg/ml牙髓卟啉单胞菌脂多糖培养液培养乳牙牙髓干细胞;空白对照组:10%FBS的DMEM培养基培养乳牙牙髓干细胞;培养48 h后收集培养上清,用ELISA kit试剂盒检测IL-1β和IL-6的蛋白含量。结果1、倒置相差显微镜下观察原代培养的乳牙牙髓干细在第9~12 d游离出组织块,胞体多为长梭形或多角形,围绕着组织块呈放射状、漩涡状排列,细胞两端伸出的胞突较细长,胞质均匀,胞核居中、圆或卵圆形,约生长20 d可达到80%汇合。免疫荧光染色结果显示:激光共聚焦显微镜下见乳牙牙髓干细胞波形丝蛋白染色荧光,少量角蛋白染色荧光。绘制第5代乳牙牙髓干细胞1~7 d的生长曲线大致呈倒“S”形。成骨诱导液培养30 d后,倒置相差显微镜下见成骨诱导组茜素红染色呈红色有大量矿化结节形成,空白对照组茜素红染色仅有少量的红染及矿化结节。流式细胞仪检测结果显示:CD29、CD105阳性表达,CD34、CD45阴性表达。2、1μmol/L、5μmol/L杨梅素与空白对照组统计学分析无明显差异(P>0.05),10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L三个浓度的杨梅素均可促进SHED增殖,并有明显的统计学差异(P<0.05);50μmol/L、100μmol/L杨梅素明显抑制SHED增殖,有明显的统计学差异(P<0.05);各组ALP活性在第5 d时达到最高,第7d时活性有所下降,在3 d、5 d和7 d分别与空白对照组相比,10μmol/L、15μmol/L和20μmol/L杨梅素均可明显促进ALP活性,具有明显的统计学差异(P<0.05),1μmol/L、5μmol/L杨梅素与空白对照组对比对SHED的ALP活性无明显的统计学差异(P>0.05)。LSD-t检验表明10μmol/L、15μmol/L和20μmol/L浓度杨梅素之间对ALP活性的影响均具有明显的统计学差异(P<0.05)。3、200mg/L LPS组与空白对照组相比SHED的OD值明显下降,具有明显的统计学差异(P<0.05);200 mg/L LPS+20μmol/L杨梅素组、200 mg/L LPS+100mg/L甲硝唑组与200 mg/L LPS组相比SHED的OD值明显增加,具有明显的统计学差异(P<0.05);200 mg/L LPS组与空白对照组相比SHED分泌IL-1β、IL-6明显增多,具有明显的统计学差异(P<0.05);200 mg/L LPS+20μmol/L杨梅素组、200 mg/L LPS+100 mg/L甲硝唑组与200 mg/L LPS组相比SHED分泌IL-1β、IL-6明显减少,具有明显的统计学差异(P<0.05);结论1、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L杨梅素对乳牙牙髓干细胞增殖能力有促进作用,低浓度5μmol/L、1μmol/L杨梅素对SHED增殖能力没有明显促进作用,高浓度50μmol/L、100μmol/L杨梅素对乳牙牙髓干细胞增殖能力具有抑制作用;2、10μmol/L、15μmol/L和20μmol/L杨梅素可以促进乳牙牙髓干细胞成骨分化;3、20μmol/L杨梅素、100 mg/L甲硝唑能拮抗牙髓卟啉单胞菌脂多糖对乳牙牙髓干细胞增殖能力的抑制作用,且杨梅素的作用优于甲硝唑;4、牙髓卟啉单胞菌脂多糖作用下乳牙牙髓干细胞IL-1β和IL-6的分泌量明显增多,20μmol/L杨梅素、100 mg/L甲硝唑能减少牙髓卟啉单胞菌脂多糖作用下乳牙牙髓干细胞IL-1β和IL-6的分泌量,且杨梅素和甲硝唑的作用没有明显的差异。