背景树突状细胞(Dendriticcells,DCs)是机体免疫系统中功能最强大的抗原提呈细胞,在免疫系统中具有特殊地位。DCs高效地摄取抗原、将其加工成多肽并与MHCⅡ类分子一同表达于细胞表面。DCs在迁移过程中成熟,从外周非淋巴组织通过淋巴管和(或)血循环进入次级淋巴器官,刺激初始T细胞活化和增殖,因此,DCs被认为是机体免疫系统的启动者和调节者,能够促进先天性免疫和启动获得性免疫,是先天性免疫与获得性免疫之间不可缺少的桥梁。目前,已有大量研究指出,牙周组织炎症是病原体感染宿主后的免疫反应,宿主免疫系统在牙周炎的发病机制中起关键作用。近年来,随着免疫学研究的进展,树突状细胞在牙周病发病中的作用也日渐受到重视。深入了解DCs在牙周病理环境中的功能变化,尤其是牙周病理环境对DCs成熟和抗原提呈功能的影响对于进一步阐明DCs在牙周炎的发生、发展中的作用显得尤为重要。本课题将全面系统地探讨P.gingivalis-LPS促进DCs成熟及抗原提呈功能的作用机制,旨在研究DCs在牙周病理微环境中的功能状态及其在牙周致病机制中的细胞免疫切入点,为研究DCs在牙周炎的发生、发展过程中的可能作用机制提供实验依据,为调节DCs免疫功能以达到改善或治疗牙周病的研究奠定实验基础。第一部分大鼠实验性牙周炎模型的建立及其牙龈、颌下淋巴结树突状细胞免疫组织化学鉴定目的 通过丝线结扎+涂布牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)的方法建立SD大鼠实验性牙周炎模型,并对其牙龈及颌下淋巴结进行DCs免疫组织化学(immunohistochemisty,IHC)检测评估。方法将12只雄性SD大鼠随机分为3组,分别为A:空白对照组、B:丝线结扎组和C:丝线结扎+P.gingivalis涂布组。在B、C两组每只大鼠双侧下颌第一、第二、第三磨牙牙颈部结扎4-0外科手术丝线,C组另于丝线周围涂布P.gingivalis。4周后处死动物,确定实验动物牙周炎模型的建立。以抗Langerin和抗CDllc单克隆抗体对牙周炎SD大鼠牙龈行IHC鉴定;以抗CDllc和抗CD80单克隆抗体对其颌下淋巴结行IHC鉴定,以确定DCs在牙周炎SD大鼠牙龈和颌下淋巴结中的状态。结果 丝线结扎+P.gingivalis涂布4周SD大鼠出现牙周炎,成功建立了 SD大鼠牙周炎模型。牙周炎SD大鼠牙龈可见CD11c+和Langerin+细胞,颌下淋巴结可见CD11c+和CD80+细胞。结论 SD大鼠实验性牙周炎模型的建立可靠,可作为牙周炎发生、发展的研究模型。牙周炎SD大鼠牙龈和颌下淋巴结可见DCs的存在。第二部分 大鼠树突状细胞体外诱导扩增方法的建立及其特性检测目的:建立获得大量DCs的稳定培养方法,为研究其特性和功能提供足够的细胞来源。方法:采用重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinantrat granulocyte macrophage colony-stimulating factor,rrGM-CSF)(10 ng/ml)和重组大鼠白细胞介素4(recombinant rat interleukin-4,rrIL-4)(1 ng/ml)诱导大鼠骨髓单个核细胞分化为未成熟DCs。第6天加入大肠杆菌脂多糖(Escherichia coli lipopolysaccharide,E.coli-LPS)(100ng/ml)刺激细胞成为成熟DCs。利用倒置相差显微镜观察细胞形态,透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察细胞器形态,流式细胞术(flow cytometry,FCM)鉴定细胞表型CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清液中细胞因子IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-13的含量,混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)检测诱导出的成熟DCs刺激同种异体CD4+T淋巴细胞增殖和分泌细胞因子的能力。结果:经rrGM-CSF和rrIL-4诱导的大鼠骨髓单个核细胞90%以上表面表达CD11c。不成熟DCs低表达CD40、CD80、CD86和MHCⅡ,分泌较少的IL-12、IFN-y、IL-10和IL-13,T细胞激活能力较弱;成熟DCs高表达CD40、CD80、CD86和MHCⅡ,分泌较多的IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-13,T细胞激活能力较强。结论:采用该种培养、诱导方法,能够培养出大量具有典型的形态、表征和功能的骨髓源性DCs。第三部分 牙龈卟啉单胞菌脂多糖促进树突状细胞成熟及抗原提呈功能的实验研究目的:研究牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.gingivalis-LPS)对DCs成熟及抗原提呈功能的影响。方法:①采用P.gingivalis-LPS刺激SD大鼠骨髓来源DCs,倒置相差显微镜和透射电镜观察其形态。②FCM检测P.gingivalis-LPS刺激下DCs表面 CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40 表达;ELISA 法检测 IL-12、IFN-γ、IL-10、IL-13分泌水平。③CCK8法检测P.gingivalis-LPS刺激下的DCs促进CD4+T细胞增殆的能力;ELISA法检测T细胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-13的能力。④在P.gingivalis-LPS和E.coli-LPS培养体系中分别加入TLR4抑制剂(polymyxin B)和TLR2/TLR4抑制剂(OxPAPC),观察其对DCs成熟和抗原提呈功能的影响。结果:①倒置相差显微镜和透射电镜结果显示,与E.coli-LPS刺激相似,P.gingivalis-LPS刺激下的DCs树突较多、细长,呈成熟状态。②FCM结果显示,P.gingivalis-LPS 刺激 DCs 成熟的能力与 E.coli-LPS 相似。P.gingivalis-LPS组DCs分泌IL-12和IFN-γ的量低于E.coli-LPS组;分泌IL-10和IL-13的量高于 E.coli-LPS 组。③P.gingivalis-LPS 和 E.coli-LPS 刺激下的 DCs 均能促进 CD4+T细胞增殖,P.gingivalis-LPS组DCs刺激T细胞分泌IL-2和IFN-γ的量明显低于E.coli-LPS组,而T细胞分泌IL-10的量则高于E.coli-LPS组,IL-13的量二者间无明显统计学差异。④在E.coli-LPS培养体系中加入TLR4抑制剂,可明显抑制DCs的成熟和抗原提呈功能。在P.gingivalis-LPS培养体系中加入TLR4抑制剂,未能抑制DCs的成熟和抗原提呈功能;加入TLR2/TLR4抑制剂,可明显抑制DCs的成熟和抗原提呈功能。结论:①P.gingivalis-LPS能促进DCs成熟和抗原提呈功能。②P.gingivalis-LPS刺激下的DCs具有较强的促进Th0细胞向Th2细胞分化的能力;E.coli-LPS刺激下的DCs具有较强的促进Th0细胞向Th1细胞分化的能力。③P.gingivalis-LPS通过TLR2信号通路激活DCs;E.coli-LPS通过TLR4信号通路激活DCs。第四部分 NOD2受体激动剂与牙龈卟啉单胞菌脂多糖协同促进树突状细胞成熟及抗原提呈功能的实验研究目的:研究 NOD2 受体激动剂(muramyl dipeptide,MDP)与 P.gingivalis-LPS协同作用,对DCs成熟及抗原提呈功能的影响,为研究DCs在牙周炎的发生、发展过程中的可能作用机制提供实验依据。方法:①采用不同浓度MDP和P.gingivalis-LPS,单独或协同刺激SD大鼠骨髓来源DCs。②FCM检测各组DCs表面 CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40 表达;实时定量 PCR(real-time RT-PCR)检测各组DCs TLR2、TLR4、NOD2 mRNA表达水平;ELISA法检测各组DCs分泌IL-12、IFN-γ、IL-10、IL-13的水平。③CCK8法检测各组DCs促进CD4+T细胞增殖的能力;ELISA法检测T细胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-13的能力。结果:①FCM结果显示,MDP促进DCs成熟的能力较弱,但MDP与P.gingivalis-LPS协同作用,可明显促进DCs成熟。PCR结果显示,P.gingivalis-LPS作用于DCs,可提高DCs TLR2 mRNA的表达,未能提高DCs TLR4 mRNA的表达;MDP 与 P.gingivalis-LPS 协同作用,可提高 DCs TLR2 mRNA 的表达。ELISA 结果显示,MDP与P.gingivalis-LPS协同作用,可提高DCs分泌IL-10和IL-13的量。②MLR结果显示,MDP与P.gingivalis-LPS协同作用能促进CD4+T细胞增殖,并促进T细胞分泌IL-10和IL-13。结论:①P.gingivalis-LPS通过TLR2信号通路激活DCs。②MDP促进DCs成熟和抗原提呈功能的能力较弱。③MDP和P.gingivalis-LPS协同作用,能提升P.gingivalis-LPS促进DCs成熟和抗原提呈功能的能力。④MDP和P.gingivalis-LPS协同作用,相较于单独使用P.gingivalis-LPS刺激下的DCs,具有更强的促进Th0细胞向Th2细胞分化的能力。