肾功能衰竭是各种急慢性肾脏损害所致一种临床危重症,肾小管萎缩和间质纤维化是其发生以及进行性恶化的主要危险因素之一,而肾小管萎缩和肾间质纤维化的发生与非适应性肾小管重塑密切相关。如能阐明肾小管重塑的过程及损伤后再生修复机制,则可采取相应干预措施,防止肾小管萎缩和间质纤维化的发生,为进一步预防肾功能衰竭的发生奠定基础。生长发育中的肾脏,受细胞周期循环调控而进行细胞发展方向的“筛选”。增殖、凋亡、增生和分化细胞群常常共存于正常的肾小管细胞群体中,在正常生长条件下通过以增殖细胞为多数比例的动态平衡来保证肾小管正常的生长发育。G1/S期的“筛选”功能,被认为是细胞周期循环中最重要的环节。成熟肾小管上皮细胞(RTEs)在生理状态下,很少逆转入胚胎发育时期的细胞周期行为,但在病理性损伤时,RTEs则发生类胚胎发育的损伤后再修复过程。在缺血缺氧性肾小管损伤早期,低氧损伤具有细胞“同步化”作用,诱导分化状态的RTEs进入细胞周期,并停滞在G1/S期,进行增殖或凋亡的“筛选”,使那些“健康存活”的RTEs通过启动S期脱氧核糖核酸(DNA)合成而进入细胞增殖周期。因此,我们推断低氧等病理损伤后受G1/S期所“筛选”的增殖RTEs具有在“率领”整个肾小管组织细胞群体定向启动适应性再生修复的过程中,势必会同时抑制成纤维细胞(Fb)的增殖。为此,本研究通过模拟受低氧干预的停留在G1/S期的即将发生增殖的RTEs与Fb共同培养,研究增殖型G1/S期RTEs对Fb的抑制作用,以验证我们的论点。为进一步研G1究/S期HKC启动成熟肾小管损伤后再生修复机制以及临床早期干预非适应性肾小管萎缩和肾间质纤维化所致的肾功能衰竭奠定基础。【目的】本研究通过模拟受低氧干预的停留在G1/S期的即将发生增殖的RTEs与Fb共同培养,研究增殖型G1/S期RTEs对Fb的生长抑制作用,以论证低氧损伤后G1/S期所“筛选”的增殖RTEs具有“率领”整个肾小管细胞群体抑制成纤维细胞(Fb)的增殖,进而定向启动适应性再生修复的作用。【方法】1、建立人肾小管上皮细胞系(HHHKKC)无血清饥饿法同步化的方法采用血清饥饿的同步化方法,探讨将HKC同步化于G0/G1期时最佳的同步化时间和胎牛血清浓度,并通过流式细胞术及细胞免疫化学方法验证同步化结果。2、建立低氧条件下HKC发生G1//S期阻滞的方法分别在低氧与正常氧条件下培养同步化于G0/G1期的HKC,采用过流式细胞术、细胞免疫化学、Westernblot及电镜方法探讨低氧对细胞周期进程的干预作用。3、探讨增殖型G1/S期HKC对WI-38细胞(人胚胎肺成纤维细胞)生长的抑制作用利用Transwell体外共同培养体系,将低氧干预后停滞于G1/S期的HKC与WI-38细胞共同培养,通过Westernblot检测WI-38细胞系中PCNA及CyclinD1变化,探讨受低氧干预后停滞于G1/S期的增殖型HKC对WI-38细胞生长的抑制作用。【结果】1、采用0.1%胎牛血清培养48h为HKC血清饥饿法的最佳同步化条件采用0%和0.1%胎牛血清的DMEM培养液分别培养24h、48h和72h后,经流式细胞术检测显示采用0%和0.1%胎牛血清的DMEM培养液在培养48h时,HKC的G0/G1比例分别为(90.9±0.9)%和(93.6±2.0)%,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。MTT生长曲线结果显示0.1%胎牛血清比0%胎牛血清同步化后HKC恢复正常培养的生长曲线更接近于正常HKC生长曲线,表明0.1%胎牛血清同步化对HKC生长影响较小。Brdu免疫细胞化学染色结果与流式细胞术结果相同。2、同步化处理后的HHHKKC在低氧条件下培养可发生GGG111//S期阻滞通过流式细胞术检测低氧和正常氧条件下同步化处理后的HKC细胞周期时相分布率的对比,提示在低氧培养12～16h时,同步化处理后HKC停留在G1/S期。Westernbolt方法证实,与对照组相比,同步化处理后的HKC在低氧培养12~16h时细胞高表达cdk2和CyclinE,证实其处于G1/S期。PCNA免疫细胞化学方法证实在同步化处理后的HKC在低氧培养12~16h具有较强的增殖性。电镜观察HKC在G1/S期选择时段未见明显凋亡现象。3、低氧干预后停滞在G1/S期RTEs抑制WI-38细胞生长同步化处理及低氧干预后阻滞于G1/S期的HKC与WI-38细胞共培养后,Westernblot检测结果表明WI-38蛋白提取物中PCNA和CyclinD1表达与对照组相比有所下调,而非同步化及低氧处理的HKC与WI-38细胞共培养后,PCNA和CyclinD1表达无显著变化。因此提示低氧干预后停滞在G1/S期的RTEs有抑制Fb的作用。【结论】经过血清饥饿同步化方法处理,在低氧干预后处于G1/S期的增殖型RTEs具有抑制Fb生长的作用。