论文部分内容阅读
日本血吸虫病是一种人兽共患寄生虫病,其主要病理损害是沉积于宿主肝脏组织的虫卵引发的肉芽肿反应以及慢性感染造成的组织损伤过度修复,进而发展成肝纤维化。传统的病原学治疗即吡喹酮杀虫,虽然可以大大降低虫体对机体的炎性刺激和持续免疫,而患者业已存在的肝纤维化病变仍有继续发展至晚期病变的趋势。纤维化是机体对炎症导致的组织损伤产生的自我修复反应,长期反复的肝脏炎症反应是肝纤维化形成的前提条件。环氧合酶-2(cyclooxgenase-2, COX-2)作为花生四烯酸合成前列腺素类物质重要的限速酶,参与炎症反应过程。近年来,研究发现COX-2在肝纤维化及肝硬化组织中表达明显增强,而在正常肝组织中表达甚微。因此,推测COX-2可能在肝纤维化形成过程中起关键作用。持续有效的抗炎症治疗是阻止纤维化进展的治疗方法之一。COX-2抑制剂塞来昔布是目前临床广泛应用的非甾体类抗炎药,在众多动物模型中被证实能抑制肝纤维化的发展。据此,本研究以BALB/c小鼠为研究对象,建立日本血吸虫感染及治疗模型,探索COX-2与血吸虫病肝纤维化的关系以及COX-2抑制剂在血吸虫病治疗中的作用。本研究技术路线为：以10条日本血吸虫尾蚴感染小鼠,建立日本血吸虫急性感染、慢性感染及治疗模型。共设计5个实验组,即正常组(uninfected)、感染6周组(6w infected)、感染12周组(12w infected)、吡喹酮治疗组(PZQ)、吡喹酮加塞来昔布治疗组(PZQ+CLC)。采用如下实验方法对COX-2、纤维化相关指标、炎性细胞因子及miRNAs等相关指标进行了检测,包括：自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)水平,HE染色评价肝脏炎症及纤维化程度,Masson染色判断胶原沉积情况,免疫组化染色评价肝脏纤维化相关因子表达情况,荧光实时定量PCR检测COX-2、肝脏炎症和纤维化相关基因表达水平以及炎性相关miRNA表达水平等,以探索COX-2抑制剂塞来昔布对血吸虫病纤维化的作用及相关机制。本研究主要结果如下：1.血清转氨酶检测结果显示：与感染12周组小鼠相比,PZQ+CLC治疗组小鼠血清ALT水平显著下降。与PZQ治疗组相比,PZQ+CLC治疗组小鼠血清ALT水平虽有下降,但两者间无统计学差异。2. RT-PCR检测肝脏COX-2结果显示：感染血吸虫后,小鼠肝脏COX-2 mRNA表达升高,但是感染12周组较感染6周组有所降低。PZQ+CLC治疗组较PZQ治疗组小鼠肝脏COX-2的表达受到显著抑制。由此推测,COX-2可能参与血吸虫感染引起的肝脏病变。3.肝脏HE染色结果显示：感染12周组小鼠肝脏中,大量虫卵聚集在汇管区附近,多个虫卵周围见成纤维细胞、类上皮细胞和胶原纤维增生,呈同心圆状包绕,外周有嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等浸润,而PZQ+CLC治疗组和PZQ治疗组则胶原纤维增生不明显,炎症反应明显减轻。与感染对照组和PZQ治疗组相比,PZQ+CLC治疗组的单个虫六卵肉芽肿面积亦明显减小。4.肝脏Masson染色结果显示：正常组小鼠肝脏切片中未见蓝染的胶原纤维。与感染12周组和PZQ治疗组相比,PZQ+CLC治疗组小鼠肝脏切片显示虫卵肉芽肿中蓝染明显减少,提示胶原纤维沉积较少。5.肝脏免疫组化染色结果显示：与感染12周组和PZQ治疗组相比,PZQ+CLC治疗组小鼠肝脏中Collagen Ⅰ、CollagenⅢ、α-SMA、MMP-9和TIMP-1表达减少。6. RT-PCR检测肝脏纤维化相关因子结果显示：与感染12周组和PZQ治疗组相比,IZQ+CLC治疗组小鼠肝脏肝纤维化相关因子Co11α1、Col3α1、α-SMA、 MMP-9、TIMP-1 mRNA水平均显著下降,且MP-9/TIMP-1比例上调。7. RT-PCR检测肝脏炎性细胞因子结果显示：感染6周组小鼠肝脏局部的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平均显著高于正常组和感染12周组；与感染12周组和PZQ治疗组相比,PZQ+CLC治疗组小鼠肝脏局部促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)及促肝纤维化细胞因子(TGF-β、IL-4和IL-13) mRNA水平均显著下降。8. RT-PCR检测肝脏miRNA结果显示：感染6周组小鼠肝脏中起促炎作用的miR-155和起抑炎作用的miR-146a的mRNA水平均显著高于正常组和感染12周组；与感染12周组和PZQ治疗组相比,PZQ+CLC治疗组小鼠肝脏miR-155和miR-146a的m RNA水平降低,且趋于正常水平。感染6周组小鼠肝脏中起负向调控COX-2作用的miR-199a和miR-101a的mRNA水平均显著低于正常组和感染12周组；与感染12周组和PZQ治疗组相比,PZQ+CLC治疗组小鼠肝脏miR-199a和miR-101a的mRNA水平升高。综上所述,本研究明确了COX-2在日本血吸虫病中的表达特征,并且COX-2抑制剂塞来昔布能够缓解病原学治疗基础上的日本血吸虫病肝纤维化,这为血吸虫病的防治提供了先导性的实验论据。