核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一种世界性分布的植物病原真菌,可以在植物的多个生育期产生危害,引起茎腐病、猝倒病、颈腐病、花期枯萎病和菌核病等。其寄主广泛,菌核存活能力强,难以防治,目前主要通过化学药剂控制该病害。　　 2006年,核盘菌的全基因组序列公布,为该菌的致病机理研究提供了有利条件。可是目前关于核盘菌的分子生物学研究较少,主要是受其转化方法的限制。至今已有PEG介导原生质体和农杆菌介导子囊孢子对核盘菌实行遗传转化,然而这些方法转化周期长、操作繁琐。针对这些问题,本课题研究了农杆菌介导核盘菌菌丝的转化体系并以此为基础对核盘菌毒力衰退相关病毒(SsDRV)下调基因Ss-CYP1的功能进行了初步探索,结果如下:　　 以植物转化载体pCAMBIA3300为基础,在SacⅠ和XhoⅠ位点连入潮霉素磷酸转移酶基因(PtrpC-HPH-TtrpC),构建得到T-DNA随机插入载体pTFSS,并将载体pTFSS导入到农杆菌菌株EHA105中。在AS存在的条件下,把农杆菌与核盘菌的菌丝碎片在20-22℃共培养。3天后,用30μg/ml潮霉素和500μg/ml的头孢霉素对共培养物进行选择性培养,结果成功得到了待定转化子。用HPH特异引物对待定转化子进行PCR鉴定,在所有待定转化子的基因组DNA中均扩增出期望片段,而在潮霉素选择性PDA培养基上不能生长的菌株中则不能扩增出期望的片段。随机挑选扩增片段测序,结果表明扩增片段均为潮霉素磷酸转移酶基因。表型上抗潮霉素的待定转化子其基因组DNA与来自HPH的探针进行点杂交具明显杂交信号,而非转化子则没有杂交信号。这些结果表明农杆菌介导可以成功转化核盘菌的菌丝。　　 转化子在PDA上连续培养90 d后,仍能在抗性平板上正常生长；并且通过t-检验分析,连续培养60 d后的菌株在生长速度上与出发菌株没有显著性差异。转化子的菌核在PDA上经6次连续的“萌发-菌核-萌发”培养后形成的菌丝也能在抗性平板上稳定生长。这些结果表明由菌丝得到的转化子在无性生长阶段的遗传上是稳定的。转化子的生物学特性研究表明,转化子在潮霉素浓度为150μg/ml的抗性平板上能正常生长；一部分转化子在生长速度、致病力、形态特征和产菌核等方面与野生型菌株出现了差异。　　 本研究还以菌丝块和菌核为受体进行了转化,发现以菌丝块为受体也能转化成功。以经过哈茨木霉裂解酶酶解后的菌丝为受体,可以克服核盘菌菌丝转化的不稳定性。对影响该体系转化效果的因素分析发现,在共培养之前农杆菌用1.2 M山梨醇悬浮和菌丝捣碎后用1.2 M山梨醇恢复培养都能提高转化效率。同时,菌丝捣碎时间30 sec和菌丝恢复培养2 h可以使转化得到较好的效果。　　 对Ss-CTP1基因的生物信息学分析表明,该基因的DNA序列含有3个外显子和2个内含子,编码含有208个氨基酸的蛋白。经Xblastx分析发现核盘菌的全基因组中有10个基因片段与Ss-CYP1有同源性；进一步预测表明,这其中有8个基因属于Cyclophilin基因家族。　　 实验室前期研究发现Ss-CYP1基因在核盘菌弱毒菌株Ep-1PN中的表达受抑制。为了研究该基因在核盘菌生长、发育和致病等过程中的作用,以植物转化载体pCAMBIA3300为基础,分别构建了Ss-CYP1基因沉默载体pSILENCE、Ss-CYP1基因超量表达载体pCYO和Ss-CYP1基因反向表达载体pCYS。利用农杆菌介导转化核盘菌菌丝的方法,成功地得到了12个Ss-CYP1基因沉默转化子、9个Ss-CYP1基因超量表达转化子和16个Ss-CYP1基因反向表达转化子。通过对这些转化子的生物学特性的研究表明,75％的Ss-CYP1基因反向表达转化子在致病力和生长速度上和对照没有显著性的差异,然而55％的Ss-CYP1基因超量表达转化子的致病力比对照增强,25％的Ss-CYP1基因沉默转化子的致病力比对照减弱。这些结果可以初步说明Ss-CYP1基因可能和核盘菌的致病力相关,进一步的验证需要通过Southern和Northern杂交证实。