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H5N1亚型高致病性禽流感(HPAI)是一种急性、高度接触性的呼吸道疾病,给养禽业造成巨大的经济损失,同时也可能引起人的感染发病,给公共卫生带来威胁。自1996年在我国广东省的某发病鹅群中分离到第一株亚洲H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)以来,H5N1亚型HPAIV在经历一系列进化后出现了多分支(clade 2.3.2.1、7.2和2.3.4.4)和多NA亚型(如H5N1、H5N2、H5N5、H5N6和H5N8等)的H5亚型禽流感病毒共流行的局面,因此迫切需要研制广谱、可以鉴别自然感染和免疫的疫苗用于禽流感的控制。本研究以A/Mallard/Huadong/S/2005 (H5N1) (S, clade 2.3.4)为母本,对其NS1蛋白和HA蛋白进行改造,通过反向遗传操作系统拯救出NS1截短和嵌合HA病毒株,并评价重组病毒的生物学特性、致病性和免疫原性。1.NS1蛋白截短对H5N1亚型禽流感病毒的致弱作用及其机制研究以H5N1亚型S株为母本,利用反向遗传技术构建分别表达NS1蛋白N-末端48 aa、70 aa、73 aa和99 aa的S-NS48、S-NS70、S-NS73和S-NS99突变病毒,S-NS48在鸡胚和CEF细胞中均表现出较弱的复制能力,其它NS1截短病毒均具有与母本病毒rS相当的复制能力；以S-NS70、S-NS73和S-NS99感染SPF鸡后仅在较易感染的肺部出现带毒现象,感染后第3 d和5 d均可在喉头及泄殖腔棉拭子中检测到NS1截短病毒,同时IVPI分别为0.65、0.74和0.84,说明NS1蛋白截短后对鸡的毒力显著下降；NS1蛋白的截短也使病毒对小鼠的致病力显著下降,S-NS70、S-NS73和S-NS99对BALB/c小鼠的MLD＞106.5EID50,小鼠感染NS1截短病毒后仅在肺部检测到一定量的感染毒。通过高通量测序分析rS和S-NS99感染SPF鸡后诱导宿主基因的差异表达,在差异最显著的10个基因中,鸡感染rS后出现趋化因子基因CCL19、CCL4,干扰素相关基因OAS*A基因和细胞因子IL-6基因的显著上调；感染S-NS99后出现趋化因子基因CCL19、CCL4、CCLI10,干扰素相关基因IFN-β、IFN-λ、IRG1、Mx、OAS*A基因的显著上调。GO功能富集性分析表明感染rS后机体产生免疫反应、趋化因子活性、细胞因子活性、炎症反应、防御病毒反应、防御反应和病毒反应等；但感染S-NS99后的抗病毒功能的富集明显较少,仅有炎症反应、防御病毒反应、病毒反应和免疫反应。KEGG信号通路分析表明,感染rS后在细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、NOD样受体信号通路、p53信号通路和RIG-I样受体信号通路相关基因等发生显著变化；而感染S-NS99后仅出现Toll样受体信号通路相关基因的显著变化,提示H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1蛋白截短后未能激活宿主相关通路基因,无法引起“细胞因子风暴”而使其毒力下降。2.H5N1亚型禽流感病毒Nsl截短减毒活疫苗的研制以H5N1亚型S株为母本,通过反向遗传操作系统拯救出裂解位点为低致病性特征的HA蛋白和截短NS1蛋白的S-HALo/NS48、S-HALo/NS70、S-HALo/NS73和S-HALo/NS99突变病毒,研究表明带有低致病HA的NS1截短病毒在鸡胚和CEF中的生长能力,对SPF鸡和BALB/c的致病特性与高致病性HA的NSl截短病毒相似。SPF鸡免疫S-HALo/NS70、S-HALo/NS73和S-HALo/NS99后第3 d诱导产生IFN-β明显高于全长NS1蛋白的重组病毒S-HALo/NSFu,但随后IFN-β的表达量下降,与S-HALo/NSF u病毒差异不显著。用流式细胞术对免疫鸡外周血淋巴细胞进行分析表明,免疫后各免疫组因CD8+T细胞数量显著上调而使CD4+/CD8+比例低于空白对照组,其中以S-HALo/NS73组变化最为明显,说明其细胞免疫反应最为强烈。攻毒保护试验表明NSl截短病毒免疫后均可对同源H5N1强毒S株攻击提供100%的保护力,但S-HALo/NS73无排毒现象；而用异源强毒株DT(clade 7.2).WX(clade 2.3.2.1).CZG(clade 2.3.4.4)攻击时,仅有S-HALo/NS73免疫组提供100%的异源保护力,排毒率也较其它NS 1截短病毒免疫组低,有望成为一株鸡用H5N1亚型禽流感减毒活疫苗的候选株。3.HA茎部嵌合型H5N1亚型禽流感病毒DIVA疫苗的研制以H5N1亚型S株和H3N2亚型流感病毒YCD、SB和YZ HA基因为模板,构建表达H5头部和H3茎部嵌合病毒cH5head/H3stalk-YCD、cH5head/H3stalk-SB和cH5head/H3stalk-YZ,3株H5/H3嵌合病毒在鸡胚中具有与野生型S-HALO一致的生长曲线。用嵌合病毒cH5 head/H3 stalk-YCD免疫SPF鸡后对母本强毒S株攻击的保护率为80%。随后原核表达H5 HA2亚基,以融合蛋白rH5-HA2作用包被抗原建立检测H5 HA2抗体的间接ELISA方法,其最佳抗原包被量为1.6μg/ml,血清稀释倍数为1：160。该ELISA方法对常见的家禽病原(IBV、NDV、ILTV、H9亚型、H3亚型、大肠杆菌和沙门菌)的血清交叉反应性弱,敏感性试验表明间接ELISA方法(1：3200)比间接免疫荧光(1：800)敏感,可用于DIVA策略的临床实践。用已建立的检测H5 HA2抗体的间接ELISA方法对H5/H3嵌合疫苗免疫后21 d和H5病毒攻毒后14 d鸡血清进行检测,结果显示免疫后21 d H5/H3嵌合病毒免疫组血清均为HA2抗体为阴性,而攻毒后血清由阴转阳,说明该间接ELISA方法可有效区分感染和免疫血清。4.HA头部嵌合型H5N1亚型禽流感疫苗的跨分支保护作用研究以H1亚型和H5亚型流感病毒HA基因为模板,构建表达H1头部和H5茎部重组嵌合病毒cH1head/H5stalk,嵌合病毒在鸡胚中具有与野生型S-HALo一致的生长曲线。以S-HALo和cH1head/H5stalk灭活乳化后对S-HALo基础免疫鸡进行加强免疫,同源S株攻毒时S-HALo组和cH1head/H5stalk组均可提供100%的保护力,且未见排带毒现象。当免疫鸡受到不同clade的异源强毒DT、WX、CZG攻击时,cH1head/H5 stalk组除可提供100%的保护率,且排毒较S-HALo组少。