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植物中的草酸钙晶体在特化细胞(晶异细胞)内的形成,是一种基本的、重要的生理代谢过程。不同植物草酸钙晶体在形态或结构上存在多样性和种间专一性;同一种植物中的草酸钙晶体往往具有特定的尺寸和形貌,并且成核后晶体的生长和晶异细胞的发育间存在显著的协同作用,这些事实均表明草酸钙的生物矿化不是一种随机的化学结晶过程,而是受到生物大分子(蛋白、多糖、糖蛋白等)的精确调控。被塑造的矿化相在特定的膜包覆空间内经历了不同的生物化学途径,最终形成热力学稳定的晶相。生物体通过复杂的分子和生物化学机制调控生物矿化的形成,尤其是通过生物矿物内部的有机基质调控晶体的形貌和晶相。目前,虽然有一些关于植物体内促进晶体成核的基质蛋白的报道,但对香蕉(Musa spp.)晶异细胞内草酸钙针晶体的形成机制仍然不清楚。本文除介绍香蕉假茎中针晶异细胞和针晶体的形态和结构特征,钙对针晶体的调控机制外,主要研究针晶体生长过程的有机基质调节机制以及体外模拟相关生物分子对草酸钙结晶动力学过程的调控等,以期揭示植物体内草酸钙的生物矿化机制。获得的主要结果如下:(1)香蕉(Musa spp.)中针晶体的形态特征及分布在香蕉(Musa spp.)的假茎气腔中沉积针晶体的细胞通常是特化的晶异细胞。晶异细胞包含成束(200根以上)的草酸钙针晶体。借助高分辨场发射扫描电镜的观察发现单根针晶体为锥形六棱或八棱晶(宽约4μm,长约150/μm)。X-射线衍射、傅里叶转换红外光谱、热失重及差热分析和拉曼光谱分析显示单根针晶体的晶相为一水合草酸钙(Calcium Oxalate Monohydrate, COM)。巴西蕉和泰国蕉来源于不同的国家但基因型相同,针晶体分布和晶体大小等特性相似,表明物种间遗传的稳定性。(2)Ca2+介导的Musa中针晶异细胞的形成借助钙离子微电极的非损伤微测技术测定晶异细胞内外钙离子流时发现,钙离子的外流仅为正常薄壁细胞的1/8,表明晶异细胞对钙离子具有明显的高吸收低外排。此外,针晶异细胞和针晶体的大小随钙离子浓度的升高而增加,表明针晶体和晶异细胞是协同生长的,并且钙离子能够调控针晶体的生长。(3)与针晶体相连的有机基质借助纳米级分辨的二次离子质谱技术,原位探测针晶体的元素分布时发现在针晶体外表面存在16O-和12C14N-二次离子,表明单根针晶体被一层有机膜所包覆(此膜可被丙酮所溶解,即定义为MA (Acetone-Soluble Matrix)。此外,在原子力显微镜(AFM)下发现针晶体内存在自组装蛋白丝(直径约为9 nnm),此有机基质可溶于甲酸,故定义为MF (Formic Acid-Soluble Matrix)。经LTQ-ESI-MS/MS确定MF蛋白的分子量为14 kDa。蛋白的C末端高度保守,且保守区域与一个细菌(Thermoplasma acidophilum DSM 1728)的伴侣蛋白chaperone protein DnaJ相似。C末端的11个氨基酸具有双亲性并富含脯氨酸(11-mer proline-rich peptide, PRP)且以无规卷曲的结构存在。(4)针晶体内自组装的纳米蛋白丝模板诱导伸长的草酸钙晶体的形成化学合成的11-mer PRP在离体条件下也可自组装形成微米长的丝状结构,并可在其表面诱导形成伸长的草酸钙晶体。成核实验表明低浓度的11-mer PRP可促进草酸钙的成核,成核后形成的晶体与对照相比显著地伸长。与成核结果不同,AFM下原位直接观测表明11-mer PRP并不影响草酸钙(-101)和(010)晶面生长的动力学过程以及台阶形貌。(5)柔韧性草酸钙针晶体的自组装AFM下原位溶解单根针晶体时发现六边形针晶体的(100)晶面上存在规则带状结构(宽约130nm),每条带由直径约130 nm的纳米球组成,而每个纳米球由四个65nm的小球构成。单根针晶体的断裂面厚度与带状结构的宽度(130 nm)接近。结合所有AFM下的原位观察结果得出埋藏在针晶体内的自组装蛋白丝调控纳米粒子有序堆砌,即纳米球围绕中心蛋白丝整齐排列并融合形成厚度相同的片层结构,这些片层结构垂直于蛋白丝长轴,最终形成锥形六棱针晶体。(6)专一性吸附抑制草酸钙的成核和生长通常与草酸钙生物矿化相关的蛋白含有磷酸化位点。选取已报道的与植物草酸钙形成有关的收钙素(Calsequestrin, CS)蛋白并合成了相关短肽CS-1和它磷酸化的对应体(1))CS-1。体相成核实验表明(p)CS-1与CS-1相比,能够显著抑制草酸钙晶体的成核并改变晶体形貌。原位AFM直接观察也证实了(p)CS-1比CS-1对(-101)面台阶生长动力学和形貌影响更明显,这表明带负电的磷酸根和带正电的(-101)面的静电作用更强,从而提高了蛋白与晶面的吸附,进而显著地抑制草酸钙的生长。综上所述,香蕉体内草酸钙针晶体形成机制的揭示,有助于理解在钙或草酸过剩的条件下,植物如何调控钙或草酸在有限的空间内形成独特形态和结构的针晶束,避免过高浓度的钙或草酸对植物造成伤害,使之适应环境并得以生存。