本文从以下两部分进行了阐述：　　第一部分 β-香树醇酯的奈基三唑衍生物促进鼻咽癌HK-1细胞凋亡的生物学效应及作用机制　　目的:本研究拟采用点击化学法设计、合成β-香树醇酯奈基三唑衍生物(triazolyl-napthyl derivative ofβ-amyrin，TNB)，并观察TNB对人鼻咽癌细胞HK-1体外增殖、凋亡的影响;通过检测药物处理前后HK-1细胞中Cyclin D1、P21、P53及凋亡相关蛋白的表达情况，验证TNB的细胞毒性是否通过促进细胞凋亡实现的;最后，评估TNB是否通过影响PI3K/AKT/XIAP信号通路来调控细胞凋亡。本文旨在探讨TNB抑制人鼻咽癌细胞HK-1增殖及诱导细胞凋亡的生物学效应及可能的分子学机制。　　方法:向含有β-香树醇酯(1500mg)的四氢呋喃溶液中加入碳酸铯(600mg)和炔丙基溴(675mg)，得到初级产物。分离出的粗产物进一步通过柱色谱纯化，得到2300mg纯品化合物（β-香树醇酯的炔丙基化衍生物）。将化合物溶于10mL叔丁醇—水中(叔丁醇∶水=2∶1)，并向其中加入抗坏血酸钠(3.5mg)和硫酸铜(1.5mg)后进行超声反应，直到薄层色谱(TLC)监测反应完成。向上述混合物中加入萘基叠氮化物（β-香树醇酯的炔丙基化衍生物2倍量），于45℃全反应完成后，用水稀释反应混合物并用乙酸乙酯萃取。有机相干燥、过滤、浓缩后计算产率。　　分别用不同浓度的TNB（0，3，6，12，24，50，100μM）处理HK-1鼻咽癌细胞24、48小时，应用MTT方法测定TNB对细胞的体外抑制效果。同时运用CCK-8方法对MTT实验测得的TNB抑制HK-1细胞活力进行佐证。随后，HK-1细胞被0，12，48和100μM浓度的TNB处理48小时之后，用Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察被TNB干扰的人鼻咽癌细胞HK-1的细胞形态学;抽提细胞内DNA，经琼酯糖胶分离和溴乙啶着色后在紫外线凝胶成像系统下观察DNA碎裂情况;进一步应用流式细胞仪分析TNB对HK-1细胞周期相分布的影响;并利用AnnexinⅤ-FITC、碘化丙啶(PI)双重染色法观察鼻咽癌细胞HK-1细胞经过不同浓度的TNB(0，12，48，100μM)处理48小时后的细胞凋亡数量;通过DCF荧光强度对TNB处理后的HK-1细胞内ROS进行检测;RT-qPCR及western blot方法分别检测不同浓度（0μM、48μM、100μM）TNB对HK-1细胞中各组分mRNA及蛋白表达量的影响，包括周期相关蛋白Cyclin D1、P21和P53、凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase7、Caspase8、Caspase9、Bax、抗凋亡分子Mcl-1、PARP以及AIF和细胞色素C。最后，用Real-time PCR及Western-Blot方法检测PI3K、AKT及XIAP的表达量，从而评估TNB是否通过影响PI3K/AKT/XIAP信号通路来调控细胞凋亡。　　结果:应用Cu(I)催化的炔-叠氮的1，3-偶联级环加成反应，可以将水溶性基因导入β-香树醇酯，从而大大改善其水溶度。在β-香树醇酯3-位的羟基上转化为炔丙基醚，再把炔基的三键经点击化学法反应转为三唑环，粗产物产率为38％。实验表明利用点击化学法合成的TNB产物改善了五环三萜皂苷类药物的稳定性、增加了溶解度，从而增加了药物的生物利用度。　　TNB对鼻咽癌细胞HK-1的细胞毒作用明显，而且抑制效应存在时间依赖性和浓度依赖性。应用Hoechst33258染色法观察到，经TNB处理的鼻咽癌HK-1细胞数量减少，且细胞形态有明显变化:细胞变圆，形态不均一，体积可见明显缩小，细胞出现核固缩、核碎裂的现象、且呈强嗜酸性，染色质凝聚至核膜周边、深染，这些现象都是细胞凋亡的表现，且随着药物浓度的升高而越来越明显。另外，凝胶电泳结果显示随着TNB的浓度的变化，细胞DNA出现了明显的阶梯状条带，说明细胞发生了凋亡，且凋亡程度随TNB浓度的增加而明显。这更进一步证实了TNB混合物是通过细胞凋亡的方式导致了鼻咽癌细胞的死亡。　　TNB诱导HK-1细胞内ROS水平的上升，不同浓度的TNB作用HK-1细胞后，细胞内活性氧水平与TNB呈浓度和时间依赖性升高。由此可知， ROS参与并促进了TNB诱导的HK-1细胞的凋亡。流式细胞术观察结果表明TNB导致鼻咽癌细胞HK-1细胞系亚-G1期细胞停滞，并且通过剂量依赖性的方式增加了细胞凋亡的限定值。在相同的时间内，G0/G1期细胞的碎片呈剂量依赖性。在S期和G2/M期的细胞比例大致上没有受到影响。Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)双重染色法显示，随着TNB浓度的增加，HK-1细胞凋亡比率明显增加。　　PCR结果显示Cyclin Dl mRNA表达水平较对照组明显下降，而P21和P53 mRNA表达水平较对照组显著增加。Western blotting检测结果显示，不同浓度TNB处理后HK-1细胞后Cyclin D1蛋白表达水平明显降低，而P21和P53蛋白表达水平明显升高，同时可见促凋亡分子Bax蛋白表达水平明显升高，而抗凋亡分子Mcl-1蛋白表达水平明显降低。另外，RT-PCR结果显示在用TNB处理细胞后，Caspase3、Caspase7、Caspase9的mRNA表达量均明显增加，且随着TNB浓度的增加，Caspase蛋白表达量上升得更明显。只有Caspase8的表达量不受TNB的影响，甚至在48μM TNB处理后表达量略微下降，但无论TNB浓度如何变化，其表达量均无明显改变。与正常对照组相比，经不同浓度TNB干预后，细胞内断裂的Caspase3和PARP以及AIF和细胞色素C的表达量有明显增加，而完整Caspase-3和PARP细胞内的表达量则明显减少。随着TNB浓度增加，这种变化愈加明显。结果表明TNB可促进线粒体凋亡信号通路激活引发细胞凋亡。在转录水平，TNB可以促进caspase-3、caspase-7和caspase-9的mRNA表达;在蛋白表达水平TNB可以呈浓度依赖性促进Cleavage-PARP、Cleavage-caspase3、AIF和CytC表达增高。　　Real-time PCR结果显示，PI3K、AKT及XIAP的mRNA相对表达量随TNB浓度增加而减少，说明TNB可下调PI3K/AKT/XIAP信号通路mRNA的表达。同时，Western-Blot结果也显示TNB处理HK-1细胞后PI3K/AKT/XIAP信号通路蛋白表达量均出现明显下降。　　结论:通过点击化学法可以有效合成β-香树醇酯奈基三唑衍生物(TNB)，增加了该药物的溶解度、稳定性和生物利用度。TNB对于人类鼻咽癌细胞HK-1的体外增殖具有明显的抑制作用。我们发现TNB通过诱发细胞凋亡及亚G1期细胞停滞，并通过下调PI3K/AKT/XIAP信号通路来抑制HK-1鼻咽癌细胞的增殖。　　第二部分 动物实验验证TNB联合放化疗方法治疗鼻咽癌的优越性　　目的:通过比对TNB法与放、化疗方法在裸鼠成瘤抑制试验中的表现，在动物水平上评估TNB联合放化疗方法的优越性。　　方法:将裸鼠分为空白组、单纯化疗组（顺柏3mg/kg）、单纯放疗组、单纯TNB组(50mg/kg)、化疗+TNB组、放疗+TNB组、放化疗+TNB组。皮下移植HK-1肿瘤细胞后，对不同组裸鼠施以相应的治疗，记录肿瘤在不同时期的体积，检测各治疗方法对裸鼠体内肿瘤生长状况的影响;免疫组化检测裸鼠移植瘤组织中Bax、Ki67表达;原位末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡情况。　　所有数据来自各个独立的试验。实验数据采用均数加减标准差X±S来进行结果的分析。采用SPSS18.0软件进行统计学处理。　　结果:体内实验中，移植瘤体后，各试验组与空白对照组比较，裸鼠体重均无明显变化，且各试验组之间比较也无差异。实验结果显示，瘤体经过4周生长和治疗，空白对照组瘤重平均值达到了1.23g，经过放化疗及TNB的治疗后，各试验组都表现出对瘤体的抑制作用，且相对于空白对照组有统计学意义。特别地，结果表明TNB治疗有放化疗增敏作用，TNB联合放、化疗治疗对肿瘤抑制效果最佳，优于单独某一项治疗组或其他联合治疗组(P＜0.05)，抑瘤率达到了65.85％。　　各试验治疗组相对于空白组Bax表达明显上调、Ki67表达明显下调，TNB联合放疗和TNB联合化疗组相对于单独治疗组Bax表达也增高，而TNB联合放、化疗组Bax的表达最高、Ki67的表达最低，与其他组有明显差异(P＜0.05)。TUNEL试验结果显示TNB联合放化疗组中凋亡程度高于其他各组，与其他各组均有统计学差异(P＜0.05)。TNB联合化疗和TNB联合放疗组凋亡率高于单纯组，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　以上结果提示各试验治疗组均能不同程度诱导肿瘤细胞凋亡，但TNB联合放化疗组较其它组凋亡率最高，治疗效果最好，TNB对放化疗有增敏作用，TNB联合放化疗治疗可以更好的抑制肿瘤细胞增殖。　　结论:体内实验表明TNB可以促进Bax促凋亡蛋白的表达并下调Ki67的表达，从而抑制HK-1裸鼠移植瘤的生长。同时TNB还可以提高鼻咽癌移植瘤对放化疗的敏感性。相比于单独TNB治疗组，TNB联合放化疗对裸鼠移植瘤的抑瘤效果最好。这可能与改变细胞周期分布、诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖等相关机制有关。