论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2, PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post weaning-pigs multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原,与猪群中发生的许多传染病密切相关。该病毒可使猪群产生严重的免疫抑制,从而易继发和并发其他传染病,加重其他传染病的临诊表现和病理过程,给世界各国养猪业带来巨大的经济损失。加之,目前PCV2商品疫苗价格高昂、质量参差不齐,且尚无有效的药物来防治PCV2相关疾病。所以PCV2的发生及流行情况的调查,对于该病的有效防控显得至关重要。而由于目前抗原制备成本较高,市场上用于PCV2血清抗体检测的ELISA试剂盒价格居高不下,所以急需一种简便、快速、灵敏、特异、价格低廉、便于大规模应用的血清学诊断与检测方法。PCV2的Cap蛋白由病毒ORF2基因编码,为PCV2主要结构蛋白,也是其主要免疫原性蛋白,具有血清型特异性抗原位点,对于PCV2的诊断与疫苗研究有较大的意义。本研究结合小分子泛素样修饰蛋白(The small ubiquitin-like modifier, SUMO)表达技术,利用大肠杆菌表达系统对PCV2去核定位信号肽的Cap蛋白(Nuclear localization signal-defected capsid protein, dCap)进行表达,建立了一种间接ELISA诊断方法,用于PCV2血清抗体的检测。1.重组表达质粒的构建及PCV2dCap在大肠杆菌中的表达利用PCR方法扩增dCap基因,将其克隆到带有SUMO和多聚组氨酸(6×His)的原核表达载体pCold-SUMO中,构建表达PCV2dCap基因的重组表达载体pCold-SUMO-dCap,将其转化到Artic Expression大肠杆菌表达菌株中,15℃低温诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明：SUMO-dCap融合蛋白获得了高效表达,约占菌体总蛋白的30%,可溶性SUMO-dCap融合蛋白约占总融合蛋白的50%。用NI-NTA树脂纯化可溶性的融合蛋白,然后利用SUMO蛋白酶特异性去除SUMO,从而得到不含任何标签的dCap蛋白。进一步的Western-blot分析表明,表达的SUMO-dCap和dCap蛋白均具有很好的免疫学反应原性。2. PCV2ELISA诊断方法的建立与应用本研究以纯化的SUMO蛋白包被ELISA板作为对照,采用纯化的SUMO-dCap蛋白为包被抗原建立了一种血清抗体ELISA检测方法。通过条件优化试验确定了最适反应条件：抗原最适包被浓度为0.938μg/mL,包被时间为4℃过夜；封闭液为1%BSA-PBST,37℃封闭2h；血清最适稀释度为1:160,37℃孵育30min;酶标抗体最适稀释浓度为1：10000,37℃孵育10min; TMB室温显色10min。判定标准为OD450nm值≥0.272者判为抗体阳性,OD450nm值≤0.233者判为抗体阴性,介于两者之间为可疑。SUMO对照试验OD450nm值均低于0.233,呈阴性。以ELISA检测试剂盒作参照,用本ELISA方法与商品化血清抗体ELISA检测试剂盒分别对267份猪血清进行平行检测。结果表明,本方法的特异性为93.33%(70/75),敏感性为96.50%(171/176),阳性和阴性总体符合率为96.02%。本ELISA方法与猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒和猪瘟病毒阳性参考血清无交叉反应。对本ELISA方法进行批内和批间重复试验,结果分别为1.25%～6.37%和6.68%～13.58%,表明该方法重复性良好。在此基础上,用建立的ELISA方法对657份临床血清样品进行了检测,结果表明送检血清中PCV2阳性率为73.82%。本研究为临床上PCV2血清抗体检测和PCV2流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法,为进一步的商品化试剂盒开发奠定了良好的基础。