目的建立多重实时荧光定量PCR检测人博卡病毒1-3型（HBoV1-3）的检测方法，并通过与普通PCR比较及测序来评估其特异性和敏感性；运用该检测方法对2009-2010年急性下呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物（NPAs）标本进行HBoV检测、测序分型，并对相关临床资料进行总结分析，以了解HBoV1-3型在长沙地区急性下呼吸道感染儿童中的流行特点，为本地区儿童呼吸道感染的防治及进一步的研究奠定基础。对象及方法1.根据文献获得并合成HBoV1-3型引物、探针的基因序列，确定反应体系。2.选取3例已知的阳性标本HBoV1、HBoV2、HBoV3各一份，经普通PCR扩增，阳性扩增产物测序鉴定，目的基因与载体连接、质粒转化到感受态细胞并增菌、提取质粒，测序确定含有目的基因的质粒，评估质粒质量后十倍梯度稀释，制作标准曲线。3.质粒稀释成101-108的标准品，通过多重实时荧光定量PCR进行扩增，评估灵敏度；选取已知分别含有不同的1种DNA和10种RNA病毒的标本、多重病毒混合标本、含有肺炎支原体和衣原体的标本、不含病毒的标本以及灭菌去离子水进行检测，评估特异性；对同一HBoV阳性标本同时进行5次测定以及连续5天对同一样本进行重复测定，评估重复性。4.收集2009年9月1日至2010年10月31日在湖南省人民医院儿科医学中心因急性下呼吸道感染住院儿童的NPAs标本。5.随机选取在湖南省人民医院儿科医学中心因急性下呼吸道感染住院儿童的NPAs标本进行多重实时荧光定量PCR和普通PCR检测，评价它们检测临床标本的敏感性和特异性。6.收集的NPAs标本经提取核酸后通过建立的多重实时荧光定量PCR检测HBoV1-3，同时采用PCR、RT-PCR及半巢式PCR方法检测RSV、HRV、IFVA/B、PIV1/2/3、hMPV、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、ADV，并测序验证。7.对2009-2010年急性下呼吸道感染住院儿童HBoV阳性检出病例的病例资料进行分析。结果1.多重实时荧光定量PCR检测HBoV不同梯度定量模板的拷贝对数值与Ct值之间呈良好的线性关系，其相关系数分别为0.999、0.999和0.998；重复性好，批内CV值为0.95%，批间CV值在102-106拷贝/反应范围波动在0.9%-2%，均小于5%；此方法的灵敏度可达到10拷贝/反应（最小浓度3.38×10拷贝/反应）。且对其它呼吸道常见病毒以及肺炎支原体、肺炎衣原体进行检测，均无扩增曲线，特异性好。2.多重实时荧光定量PCR与普通PCR对171份NPAs进行了HBoV平行检测，多重实时荧光定量PCR检出27份阳性，普通PCR检出16份阳性，且所有普通PCR阳性样本均存在于多重实时荧光定量PCR检测的阳性样本中，两种方法检测的阳性产物均进行测序鉴定，多重实时荧光定量PCR检出的27份阳性标本中有4份为假阳性。3.2009年9月1日～2010年10月31日共收集急性下呼吸道感染住院儿童的NPAs标本775份，其中检出HBoV阳性110例，总检出率为14.19%；HBoV1检出107例，检出率为13.80%；HBoV2检出3例，检出率为0.39%；未检出HBoV3。在110例HBoV阳性检出病例中，男性患儿的检出率为14.26%，女性患儿的检出率为14.07%，男女之比为1.01：1，无性别差异（χ2=0.005，P=0.944）。HBoV阳性患儿的年龄在22天-13岁2月之间，平均年龄为18个月。5岁以下占96.36%，3岁以下占86.36%。夏季检出33例（1例为HBoV2）、春季30例（2例为HBoV2）、冬季26例、秋季21例。HBoV阳性检出病例主要的诊断为支气管肺炎、毛细支气管炎和支气管哮喘并肺部感染。在检测的所有HBoV阳性标本中，34.54%的为单独感染，65.45%的为混合感染，在单一HBoV阳性病例中发热者混合其他病毒阳性的病例常见（P=0.016）；而HBoV混合其它病毒阳性检出病例中有基础疾病的例数多于单一HBoV检出病例（P=0.015），其他临床情况比较差异无统计学意义。结论1.本研究成功构建了多重实时荧光定量PCR检测HBoV1-3的方法。2.多重实时荧光定量PCR对临床标本HBoV的检测比普通PCR快速、敏感。3.采用多重实时荧光定量PCR可检出急性下呼吸道感染住院儿童NPAs标本中的HBoV1和HBoV2。4.本研究期间，HBoV1的检出率较高，可能是本地区儿童急性下呼吸道感染的重要病毒病原之一。