目的新生儿细菌性脑膜炎是儿科严重感染性疾病之一,临床上尽管可以选用相应的抗生素治疗,但是病死率仍然得不到显著的改善。幸存者常伴有失听、失明、癫痫、智力和运动障碍后遗症。因此,探讨有效的新生儿细菌性脑膜炎的防治策略具有重要意义。大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)是导致新生儿脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌。从脑膜炎患儿脑脊液中分离的大肠杆菌中,80%以上均带有K1荚膜。现已清楚,E.coli K1通过血行播散入脑而引起脑膜炎。但是,血液中的E.coli K1如何穿过主要由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)组成的血脑屏障(blood brain barrier, BBB),迄今尚不清楚。借助于体外分离培养的人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMECs)单层——血脑屏障模型,学者们先后鉴定了E. coli Kl中的参与侵袭HBMECs相关基因,如fimH, ompA, ibeA, ibeB, CNF1等,并对参与E.coli K1侵袭相关的细胞内信号转导通路如PI3K、PKB、PKC、RhoGTPase以及FAK等细胞骨架组装调控信号分子等进行了探讨。但已鉴定的这些E. coli K1穿过BBB的“决定因子”,特别是每个E. coli K1侵袭基因介导细菌侵袭HBMECs的功能差异、联系、及详细机制尚有待进一步研究。我们在先前的研究中,从致新生儿脑膜炎E.coli K1株RS218(O18:K1:H7)中克隆鉴定了一个E.coli K1毒力岛基因GimA (genetic island of meningitic E.coli containing ibeA)(图1)。GimA全长20.3kb,仅存在于E.coli K1,其他非脑膜炎大肠杆菌中如E.coli K12均不含GimA序列。GimA含有四个操纵子,编码15个基因：(1)ptnIPKC (GimAl),包括ptnI、ptnP、ptnK、ptnC;(2)CglDTEC(GimA2),包括cglD、cglT、cglE、cglC;(3)GcxKRCI(GimA3),包括gcxK、gcxR、gcxC、gcxI; (4) IbeRAT(GimA4),包括ibeR、ibeA、ibeT。其中,ibeA基因的功能已得到初步研究,它在Kcoki K1侵袭HBMECs中起作用；其余14个基因的功能尚不清楚。GimA中推断的各基因编码蛋白与目前GeneBank库中功能已知蛋白之间的同源性高低程度分析结果提示：GimAl中ptnl与磷酸烯醇型丙酮酸磷酸化转移酶有很高的同源性；GimA2中cglD与甘油脱氢酶的同源性为62%;GimA3中gcxC与乙醛酸.醛连接酶的同源性高达67%;GimA4中含有E.coli K1侵袭HBMECs有关的ibeA,而其中的两个基因ibeT和ibeR尚未发现与其他蛋白有较高的同源性,鉴于这两个基因与ibeA同处于一个操纵子,故提示可能参与E.coli K1侵袭HBMECs.探讨这些基因在Ecoli Kl致脑膜炎中的作用,可以使我们更好的了解大肠杆菌性脑膜炎的发病机制。因此,我们选取了GimA2中的cglD基因和GimA4中的ibeT基因作为研究对象,展开了本工作。方法一、大肠杆菌毒力岛基因cglD的功能研究(一)细菌培养大肠杆菌以LB培养基培养,在行细胞侵袭试验前,用含有利福平的BHI培养基培养E44。(二)细胞培养HBMECs于含有10%FBS、10%Nu血清的RPMI-1640培养液中,于37℃、5%CO2、100%湿度的条件下培养。(三)E44:△cglD基因缺失突变株的构建将携带打靶基因两侧DNA片段的自杀性质粒pCVD442通过细菌间的接合传递到E44中,利用菌体内同源交换,从E44中剔除cglD基因。(四)互补实验将cglD基因的ORF克隆到质粒pFN476上,将其与pGP1-2共同转化给E44:△cglD。(五)细菌黏附和侵袭试验1、细菌黏附试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,收集细胞内外的细菌,结果用相对黏附力表示；2、细菌侵袭试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,收集细胞内的细菌,结果用相对侵袭力表示。(六)半数致死量和生存分析Bliss法计算大肠杆菌对新生鼠的半数致死量；Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。(七)新生大鼠实验性细菌性脑膜炎模型的建立皮下注射一定浓度的细菌,建立新生大鼠菌血症模型,脑膜炎模型由血行播散而致。(八)脑脊液白细胞计数及蛋白和乳酸含量的测定血细胞计数板计数脑脊液白细胞,BCA蛋白定量法测定脑脊液蛋白含量,乳酸脱氢酶比色法测定脑脊液乳酸含量。(九)组织病理学分析新生大鼠脑切片经HE染色后,显微镜观察脑膜以及大脑皮层区中性粒细胞的浸润。(十)人多形核白细胞(PMNs)跨内皮迁移实验从人新鲜的外周血中分离PMNs,计数经大肠杆菌趋化后穿过HBMECs单层的PMNs。(十一)重组蛋白的表达和纯化利用BL21(DE3)表达含有cglD基因的重组质粒,用亲和层析法纯化融合蛋白。(十二)甘油脱氢酶活性分析比色法测定菌体裂解液和纯化蛋白的甘油脱氢酶活性。二、大肠杆菌毒力岛基因IbeT的功能研究(一)细菌培养大肠杆菌以LB培养基培养,在行细胞侵袭试验前,用含有利福平的BHI培养基培养E44。(二)细胞培养HBMECs于含有10%FBS、10%Nu血清的RPMI-1640培养液中,于37℃、5%CO2、100%湿度的条件下培养。(三)E44:△ibeT基因缺失突变株的构建将携带打靶基因两侧DNA片段的自杀性质粒pCVD442通过细菌间的接合传递到E44中,利用菌体内同源交换,从E44中剔除ibeT基因。(四)互补实验将ibeT基因的ORF克隆到质粒pFN476上,将其与pGP1-2共同转化给E44：△ibeT。(五)细菌黏附和侵袭试验1、细菌黏附试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,收集细胞内外的细菌,结果用相对黏附力表示；2、细菌侵袭试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,收集细胞内的细菌,结果用相对侵袭力表示。(六)细菌在细胞内存活试验向HBMECs单层加入1×107个过夜培养的大肠杆菌,作用1.5h后,杀死细胞外的细菌,在继续培养指定时间收集细胞内的细菌,结果用菌落数表示。(七)细菌生长曲线测定将细菌接种于一定体积的培养基中培养,测定大肠杆菌在不同时间点波长为600 nm时的吸光度值,绘制生长曲线。(八)免疫荧光实验激光共聚焦扫描显微镜进行观察。(九)透射电镜观察利用超薄切片机将包埋块切成70～80nm的超薄切片,经染色后,利用透射电子显微镜观察。(十)细菌缓冲容量测定通过测定细菌胞内和胞外总的缓冲容量和细菌胞外缓冲容量,计算得到细菌胞内缓冲容量。结果一、大肠杆菌毒力岛基因cgID在实验性新生儿脑膜炎中的作用1、E.coli Kl等位基因cglD缺失突变株的构建2、cglD基因缺失延长脑膜炎模型鼠的存活时间,但并不影响E.coliK1穿过血脑屏障3、cglD基因的缺失减轻了脑膜炎模型鼠脑脊液的改变4、cglD基因的缺失减轻了脑膜炎模型鼠脑膜和脑皮质区中性粒细胞的浸润5、CglD蛋白具有甘油脱氢酶的活性二、毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解1、E.coli K1等位基因ibeT缺失突变株的构建2、E.coli K1 ibeT基因缺失影响E.coli K1侵袭HBMECs3、ibeT基因缺失抑制了E.coli K1在HBMECs中的生长4、ibeT基因缺失导致E.coli K1逃逸HBMECs溶酶体的能力发生缺陷5、ibeT基因有利于E.coli K1从ECV中逃逸入细胞浆6、敲除ibeT基因后的E44:△ibeT突变株菌体胞内的缓冲容量下降结论毒力岛基因cglD作为E.coli K1的毒力因子,有利于E.coli K1的体内毒力,参与脑膜炎的炎症反应,但与穿越血脑屏障无关,cglD蛋白具有甘油脱氢酶的活性。毒力岛侵袭基因ibeT有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制。