论文部分内容阅读
目的双磷酸盐如唑来膦酸(zoledronic acid, ZA)被广泛用于与代谢性疾病和与肿瘤相关的骨疾病的治疗。然而最近双磷酸盐治疗的病人出现一种严重的并发症双磷酸盐相关性颌骨骨坏死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw, BRONJ)。BRONJ发生于口腔创伤后,并被证实主要是伤口愈合较差,软组织断裂,随后死骨形成并暴露。目前对BRONJ没有有效的临床治疗措施。本研究在体外培养人牙龈成纤维细胞的基础上,将其暴露于不同浓度(0-10μM)ZA,观察随浓度和时间增加出现的细胞学效应,观察唑来膦酸对牙龈成纤维细胞增殖凋亡的影响,探讨唑来膦酸导致BRONJ的发生机制,为临床上使用唑来膦酸辅助治疗肿瘤提供参考资料和理论依据。方法原代培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, HGF),取第3-6代用于实验。利用不同浓度(0,0.5,1,5,10μM)ZA作用于HGF,24小时后,倒置显微镜观察细胞形态；罗丹明123染色,荧光显微镜观察各组荧光强度；AnnexinV/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡率,量化分析各组凋亡细胞数目。采用四甲基偶氮唑盐比色法((?)methyl thiazolyl terazolium, MTT)和细胞增殖度法动态监测长期用药对HGF增殖的影响。结果1.采用组织块原代培养法成功培养出人牙龈成纤维细胞。倒置显微镜下观察可见,组织块接种3-7天后即有细胞从其周围游出,细胞呈长梭形,并围绕组织块呈放射状排列。传代后细胞生长迅速,性状稳定。2.ZA用药24h后直接显微镜观察发现,随着药物浓度的升高,细胞间间隙增宽,胞体皱缩,胞浆浓缩,且有细胞死亡脱落,凋亡细胞数目增加。罗丹明123染色,荧光显微镜下观察,对照组荧光强度高于实验组,且随着ZA浓度的增加,荧光强度呈递减趋势,说明随着ZA浓度的升高,细胞凋亡数目增加。流式细胞仪的AnnexinV/PI双染色法发现,本研究中从1μM开始,随着ZA浓度的升高,凋亡率显著升高(P<0.05),0.5μM组与对照组无明显差异。3.MTT法检测结果显示,1-10μM用药24h对HGF的增殖作用均较对照组有明显差异(P<0.05),0.5μM组与对照组相比则无明显差异(P>0.05)。细胞增殖度法观察用药在0.5μ10μM和7天范围内表现为浓度-时间依赖效应,随着浓度升高,时间延长,细胞增殖抑制更显著,各不同浓度组之间存在统计学差异(P<0.05)。结论1.采用组织块原代培养法可成功培育出人牙龈成纤维细胞,细胞传代后,生长旺盛,分裂较快,性状稳定,能够满足实验中所需的大量细胞。2、ZA用药24h后即可见明显的促进HGF凋亡作用,低于1μ M无明显促进作用,在1-10μM浓度范围内,随着浓度升高,促进凋亡作用更显著。3、ZA具有抑制HGF增殖的作用,用药24h后,1μM浓度ZA即发挥抑制作用,随着时间延长,抑制作用增加。