负压封闭引流(vacuum sealing drainage, VSD)技术,又称为负压创面治疗技术(Negative Pressure Wound Therapy, NPWT)或者真空辅助闭合(Vacuum Assisted Closure, VAC)技术,是指经过清创处理的创面,用内部含有引流管(硅胶引流管)的聚乙烯醇泡沫敷料(VSD敷料),覆盖或填充皮肤、软组织缺损部位,再用透明透气粘胶贴膜将其完全封闭,形成一个封闭的空间,最后连接相应的的负压吸引装置,通过间歇性低负压来促进创面愈合的一种全新治疗手段。负压封闭引流技术是由Fleischmann等首创,最早在美国临床推广使用。近年来对于慢性创面的愈合、骨科开放性损伤以及大面积皮肤撕脱伤的治疗应用较为广泛,其临床价值以及临床疗效也受到越来越多的认可和关注。VSD技术既能够增加创面血供,减轻创面水肿,避免交叉感染,抑制细菌繁殖,又能够改善创面的血液循环,刺激肉芽生长,加速创面愈合,同时减少患者换药次数,减轻患者痛苦,减少临床医生工作量,缩短患者住院时间及减少医疗费用等。但VSD技术亦存在不足,抗感染能力欠佳就是其中的一方面。临床上部分使用VSD治疗的患者伤口仍存在不同程度的感染。而传统庆大霉素溶液局部冲洗,易导致细菌耐药,给二期的皮瓣移植或者植皮带来风险,更严重的可能导致肢体坏死甚至危及生命。臭氧是一种由三个氧原子组成的淡蓝色、有腥臭味的气体。它是1840年由德国科学家Schorbein发现并命名。臭氧具有较强的氧化性,对于散布在空气或溶于水中的有害物质或者病原微生物可以直接或间接的进行氧化,使之分解破裂或者直接达到杀菌的作用。臭氧水则是利用特殊的装置将臭氧气体加压溶于灭菌用水中形成,是一种新型广谱杀菌消毒剂,具有使用方便、刺激性低、作用快速、降解代谢产物为水和空气、无污染等突出优点。目前臭氧水在水处理、化学氧化、食品加工储藏、医疗卫生等领域发挥了重要的作用,有实验研究已经证实其对感染性创面的冲洗有较好的疗效。目前尚缺乏将VSD材料与臭氧水相联合应用治疗感染创面的实验报道。能否将臭氧水与负压封闭引流技术相结合,利用二者的优点,既充分发挥VSD技术抗感染的能力,又能杀灭创面的细菌,避免厌氧菌、耐药菌的产生,促进伤口的血液循环和肉芽生长,为二期皮瓣或者植皮手术以及创面的愈合提供一个安全稳定的环境,本研究旨在探讨二者联合的可行性、稳定性和安全性。我们前期的实验已经证实10μg/ml浓度的臭氧水与VSD技术联合应用材料的安全性。选择10μg/ml臭氧水的主要原因有两点,一是根据文献报道该浓度的臭氧水能杀灭绝大多数的病原菌；二是高浓度臭氧水可能对机体组织带来一定的氧化损伤作用。所以我们必须满足杀灭细菌的基本要求的同时,又不能对正常机体组织产生损害。本实验则主要通过三部分实验来论证10μg/ml浓度的臭氧水与VSD技术联合应用的安全性和可行性,为后续的相关动物实验和最终的临床的推广应用奠定初步的理论基础。第一部分实验内容是皮内刺激反应实验,包括不同体积VSD泡沫材料与10μg/ml臭氧水结合后的浸提液的制备、VSD材料溶于酒精后浸提液的制备、制备后的浸提液分别注入新西兰大白兔皮内后,不同时间点观察动物皮肤对于浸提液的反应情况；第二部分为迟发型超敏反应实验。应用豚鼠最大反应剂量法,将10μg/ml臭氧水与VSD泡沫材料等体积浸泡后形成的浸提液,分别采用皮内注射和局部敷贴的方法,经过皮内诱导阶段、局部诱导阶段和激发阶段24和48h后观察实验浸提液对白化豚鼠的皮肤反应情况,再按照Magnusson和Kligman分级标准观察评价对豚鼠的致敏结果；第三部分通过采用体外细胞毒性试验(细胞增殖度法,MTT法),分别将不同浓度的浸提液培养细胞,并计算细胞相对增殖率(RGR),采用电镜下大体观察以及6级细胞毒性评价标准来鉴定实验材料的可行性和生物安全性。第一部分VSD材料与10μg/mL臭氧水联合浸提液的制备和皮内刺激反应实验目的：制备浓度为10μg/ml的臭氧水,然后与VSD泡沫材料(5cm*5cm*lcm)充分浸泡反应后制备浸提液,用新鲜制备的浸提液对新西兰大白兔行皮内刺激反应实验。材料与方法：1、臭氧水的制取：将注射用灭菌注射用水注入臭氧水发生器(Ozonosan Alpha Plus1107型)的储水槽中,打开氧气阀,待气体充分饱和后,打开进气阀,将新鲜产生的臭氧气体加压溶于灭菌用水中制取10μg/ml的臭氧水,制取后即保存于棕色试剂瓶中。2、VSD泡沫材料与10μg/ml臭氧水浸提液的制备：在经过杀菌消毒的超净台中,分别将体积比为1：1和1：2的VSD泡沫材料(5cm*5cm*lcm)与新鲜制备的浓度为10μg/ml臭氧水,在玻璃烧杯中进行充分浸泡接触反应后(浸泡反应时间为12小时),制备得到体积比为1：1和1：2的实验用浸提液。3、皮内刺激反应实验：用新西兰大白兔10只,随机分为实验组Ⅰ(VSD材料与臭氧水体积比为1：1)、实验组Ⅱ(VSD材料与臭氧水体积比为1：2)各5只。试验前12h除去兔背部脊柱两侧被毛,形成大小为4cm×8cm的实验区域。常规酒精消毒后。实验组Ⅰ在兔脊柱左上部区域有序排列的5个点各皮内注射0.2ml浸提液(VSD材料与臭氧水体积比1：1),类似地,左下部区域注射0.2ml臭氧水；右上部区域注射0.2ml浸提液(VSD材料与生理盐水体积比1：1),右下部区域注射0.2ml生理盐水。各注射点之间间隔lcm。实验组Ⅱ操作步骤同上。注射后观察并记录即刻、24h、48h、72h后各注射部位的红斑和水肿状况。根据皮内刺激反应评分标准,计算原发性刺激记分。同理计算出对照组评分。随后计算出各时间点的原发性刺激指数。结果：成功制取浓度为10μg/ml的臭氧水,得到VSD泡沫材料与浓度为10μg/ml臭氧水体积比分别为1：1和1：2的浸提液。进行新西兰大白兔的皮内刺激反应实验,实验组Ⅰ与实验组Ⅱ中各组注射区域均未见明显红斑、水肿和溃疡反应,原发性刺激评分和原发性刺激指数均为O。结论：本实验所用Ozonosan Alpha Plus1107型臭氧水机,可制取浓度与性质稳定的10μg/ml臭氧水；所制备的不同浓度的浸提液分别行皮内刺激反应为阴性,初步证明浓度为10μg/ml的臭氧水相联合VSD泡沫材料具有良好的生物安全性和临床可行性。第二部分VSD材料与10μg/ml臭氧水联合浸提液的迟发型超敏反应实验目的：制备浓度为10μg/ml的臭氧水,然后与VSD泡沫材料(5cm*5cm*1cm)充分浸泡反应后制备浸提液,采用浸提液浓度最大剂量法对白化豚鼠行迟发型超敏反应实验。材料与方法：1、实验方法与实验分组：本实验采用豚鼠最大反应剂量法。实验分组将20只白化豚鼠随机分为三组,即：实验组(10只)、臭氧水对照组(5只)、生理盐水组(5只)2、臭氧水的制取：将注射用灭菌注射用水注入臭氧水发生器(Ozonosan Alpha Plus1107型)的储水槽中,打开氧气阀,待气体充分饱和后,打开进气阀,将新鲜产生的臭氧气体加压溶于灭菌用水中制取10μg/ml的臭氧水,制取后即保存于棕色试剂瓶中。3、VSD泡沫材料与10μg/ml臭氧水浸提液的制备：在无菌的超净台中,将体积比为1：1的VSD泡沫材料(5cm*5cm*1cm)与新鲜制备的浓度为10μg/ml臭氧水,玻璃烧杯中进行充分浸泡接触反应后(浸泡反应时间为12小时),制备得到实验用浸提液。4、迟发型超敏反应实验：实验前12h去除白化豚鼠颈后区两侧被毛,形成大小为5cm×5cm的致敏区。实验组皮内注射和局部敷贴采用浸提液(体积比为1：1),臭氧水组为浓度为10μg/ml经12h自然代谢后的臭氧水。皮内局部诱导反应7d后进行,14d后进行敷贴激发反应。分别在除去敷贴后的24h和48h后观察贴敷部位皮肤的红斑和水肿情况。对照组为生理盐水同法处理。按照Magnusson和Kligman分级标准对致敏结果进行分级评分。结果：成功制取浓度为10μg/ml的臭氧水,得到VSD泡沫材料与10μg/ml臭氧水体积比为1：1的浸提液。进行白化豚鼠的迟发型超敏反应实验,浸提液实验组、臭氧水对照组与生理盐水组,各组各时段激发部位均未见红斑和水肿反应,阳性率为0。结论：本实验所用的豚鼠最大反应剂量法进行的迟发型超敏反应实验,初步证明浓度为10μg/ml的臭氧水相联合VSD泡沫材料具有良好的生物安全性和临床可行性。第三部分VSD材料与10μg/ml,臭氧水联合浸提液的体外细胞毒实验目的：制备浓度为10μg/ml的臭氧水,然后与VSD泡沫材料(5cm*5cm*1cm)充分浸泡反应后制备浸提液,采用不同浓度浸提液进行体外细胞毒实验1、实验方法与实验分组：本实验采用细胞增殖度法(MTT法)。实验分组将接种小鼠成纤维细胞后的96孔板,随机分为不同浓度实验组(浸提液浓度为1：1、1：5、1：10、1：15、1：20)、阴性对照组(RPMI1640培养基)、阳性对照组(DMSO)以及臭氧水对照组。每组6孔。2、臭氧水的制取：将注射用灭菌注射用水注入臭氧水发生器(Ozonosan Alpha Plus1107型)的储水槽中,打开氧气阀,待气体充分饱和后,打开进气阀,将新鲜产生的臭氧气体加压溶于灭菌用水中制取10μg/ml的臭氧水,制取后即保存于棕色试剂瓶中。3、VSD泡沫材料与10μg/ml臭氧水浸提液的制备：在经过杀菌消毒的超净台中,将不同体积比(1：1、1：5、1：10、1：15、1：20)的VSD泡沫材料(5cm*5cm*1cm)与新鲜制备的浓度为10μg/ml臭氧水,在玻璃烧杯中进行充分浸泡接触反应后(浸泡反应时间为12小时),制备得到不同浓度的实验浸提液。4、实验组细胞培养液的制备：将新鲜制备的不同体积比的浸提液0.5ml与9.5ml RPMI1640细胞培养液混合制成浓度5%的实验用细胞培养液。阳性对照组：浓度为5%DMSO细胞培养液；阴性对照组：RPMI1640细胞培养液；臭氧水组：10μg/ml经12h自然代谢后的臭氧水0.5ml与9.5mlRPMI1640培养液混合制成。5、体外细胞毒实验(细胞增殖度法,MTT法)：将L-929小鼠成纤维细胞制成4×107个/L的细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔200μl,培养箱内(37℃,5%C02)培养24h,观察细胞贴壁后弃掉原液,再用PBS洗涤3次。将接种细胞后的96孔板,随机分为不同浓度实验组(浸提液浓度为1：5、1：10、1：15、1：20)、阴性对照组(RPMI1640培养基)、阳性对照组(DMSO)以及臭氧水对照组。每组6孔,每孔均为200μl。将处理后的96孔板培养120h,并且于第1,2,3,4,5天弃掉原培养液,然后加入20μg1MTT(质量浓度为5mg/ml),再置于培养箱内4h后终止培养。吸去上清液,立即加入二甲基亚砜(DMSO)150μl/孔,后置于振荡箱内轻微振荡10min。用酶联免疫检测仪(波长490nm)测定其吸光度(A)值,记录结果。计算细胞相对增殖率(RGR)。RGR=(实验组A均值/阴性对照组A均值)×100%。采用6级制进行细胞材料细胞毒性分级(cytoxicity scale, CTS)。6、统计学方法吸光度和细胞相对增殖率值(RGR)均用(X±S),采用SPSS13.0系统对各时间点各组数据进行单因素方差分析,组间两两比较采用(Least Significant Difference, LSD)法。7、结果：7.1细胞形态学观察1d后各组细胞均贴壁生长,细胞呈梭形,折光性强、细胞突充分伸展,可见分裂细胞,阳性对照组可见较多的圆形及少量悬浮细胞。3d后各组细胞数量均显著增多,呈梭形、三角形以及不规则形,单层排列密集规则,多见分裂相。其中实验组、阴性对照组、臭氧水组在细胞数量以及形态未见明显差别,悬浮细胞以及圆形细胞较少。而阳性对照组细胞总数较少,可见较多圆形或者悬浮细胞。5d后除阳性对照组外,各组细胞数量未见显著增多,细胞形态多样。各组间的细胞数量和形态未见明显差别。初步判断材料与臭氧水结合的浸提液无细胞毒性。而阳性对照组的椭圆形和悬浮细胞的数量显著增多,死亡细胞也显著增多。而浓度为1：1的实验组从开始培养到第5天结束均可见细胞呈圆形,未生长,大量悬浮,折光性较差。7.2各个实验组不同时间的细胞增殖活性随着时间的增加,各实验组A490呈现增大的趋势,不同时间点各实验组以及臭氧水对照组的A490与阳性对照组(DMSO)相比差异均有统计学意义(P<0.05)。而各实验组与阴性对照组(RPMI1640)A490匕较差异无统计学意义(P>0.05)。8.结论：本实验所用的体外细胞毒实验(细胞增殖度法,MTT法),实验组、臭氧水组、阴性对照组的L-929小鼠成纤维细胞不同时间点的毒性反应均为0-Ⅰ级,无细胞毒性。而度为1：1的实验组的L-929小鼠成纤维细胞受到抑制而死亡,可见臭氧水与VSD泡沫材料结合确实产生某种可以明显抑制细胞生长的物质,阳性对照组毒性反应均为Ⅱ级,有轻度细胞毒性。总体上证明VSD材料与10μg/ml臭氧水联合应用所得的浸提液具有良好的生物安全性。