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MABV(marine birnavirus)属于双RNA病毒科(Birnaviridae)水生生物双RNA病毒属(Aquabirnavirus)。MABV基因组的两个片段包括一个3.1kb的A片段和2.8kb的B片段。片段A编码一个106 kDa的多肽和一个小分子量VP5蛋白(15-17 kDa);片段B编码一个大小为90 kDa的VP1蛋白,它是一种依赖于RNA的RNA聚合酶。片段A编码的多蛋白的排列顺序是NH2-VP2-NS-VP3-COOH,它在VP2-NS和NS-VP3连接处被具有蛋白酶活性的NS(又名VP4)进行翻译后的剪切加工,成为VP2、NS(VP4)和VP3。VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白。本文对MABV Y-6病毒的VP2e基因、VP3基因和VP5基因在细胞内的表达情况及其表达产物的功能做了一些研究和分析。研究结果如下: 1、VP5基因的克隆、表达及其功能研究 克隆了MABV Y-6病毒的VP5基因,并在大肠杆菌中表达了VP5基因。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1mM优化的条件下,其表达量较低,仅占细胞总蛋白的7.3%。 构建重组病毒供体质粒pFastBacHTe-VP5,转化DH10 Bac菌株,获得重组DNA。重组DNA在脂质体的作用下转染昆虫细胞,获得重组病毒Bacmid-eGFP VP5。与重组病毒Bacmid-eGFP感染昆虫细胞相比,重组病毒Bacmid-eGFP VP5感染昆虫细胞后,细胞活力增加,细胞基因组DNA延迟降解,Caspase-3活力降低。由此我们初步确定VP5基因是一个抗细胞凋亡基因。 2、VP2e基因的表达及其表达产物分析 构建了VP2e基因原核表达载体pGEX-6P-1-VP2e,并在大肠杆菌中表达了VP2e基因。在温度为37℃、IPTG浓度为0.1 mM时,表达的GST-VP2e融合蛋白相对最高,占细胞总蛋白的28.6%。纯化表达的GST-VP2e融合蛋白,利用其作为免疫抗原,制备了兔抗GST-VP2e融合蛋白多克隆抗体,其效价达到1:512,000。 构建重组病毒供体质粒pFastBacHTe-VP2e,转化DH10 Bac菌株,获得重组DNA。重组DNA在脂质体的作用下转染昆虫细胞,获得重组病毒rBacmid/eGFP-VP2e,并感染昆虫细胞,结果表明VP2e融合蛋白的表达占昆虫细胞总蛋白的15.8%,并主要以可溶性蛋白的形式存在。 利用制备的兔抗GST-VP2e融合蛋白多克隆抗体,对VP2蛋白在细胞中的表达情