帕金森病(PD)是一种常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病，其主要病理改变为黑质纹状体系多巴胺(DA)能神经元进行性变性死亡，纹状体DA含量降低。由于其病因和发病机制尚不明确，目前的所有治疗手段，包括药物治疗和各种外科手术、脑组织移植等均只限于暂时的症状改善，不能从根本上延缓或阻止其病程进展。理想的PD治疗方法除了要纠正其脑内DA含量的不足，还要保护残存的DA能神经元。目前认为，基因治疗将可能是实现这一目标的最佳途径。 迄今为止，国内外有关PD基因治疗研究探索主要集中于两个方向：一是通过给予酪氨酸羟化酶(TH)基因，提高DA在脑内的生物合成。二是通过给予各种神经营养因子或抗凋亡分子基因，探索其对DA能神经元的保护作用。研究表明，胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)是目前已知的对DA能神经元最强有力和最具特异性的保护因子，GDNF基因在脑内的有效表达，可以减缓、阻止甚至逆转DA能神经元的退行性病变过程。虽然上述研究取得了一些突破和进展，但结果尚不理想。因为目前PD基因治疗研究多采用单基因方法，而引起PD的因素很多，单靠给予某一种基因或因子所起的效果有限，同时应用两种或两种以上的基因治疗可能更具疗效，而将TH和GDNF基因结合起来，则既能增加脑内DA的合成，又能保护DA能神经元，无疑是PD的理想治疗方法。 本研究采用了分子克隆、细胞培养和脑立体定位注射技术等研究方法，分别将TH、GDNF和绿色荧光蛋白基因(GFP)构建入重组腺相关病毒(rAAV)载体中，并分别包装出含有三种目的基因的假病毒，即rAAV-TH、rAAV-GDNF、rAAV-GFP，通过离体细胞感染研究证实其具有明确的转基因生物学活性后，再将其分别或联合注射到内侧前脑束(MFB)切割损伤的PD大鼠模型脑内，以了解rAAV-TH的治疗作用和rAAV-GDNF对DA神经元的保护功能，并进一步探索rAAV-TH和rAAV-GDNF联合移植的治疗效果，以寻找PD基因治疗的最佳途径。＿．、wtf｝41：：a’：．－－＊＊x＊。；；账～赚披－4＜．p社义 主要研究方法和结果如下：1．观察到rAAV－GFP在感染293细胞后1天即有表达，1周时表达达 到高峰，且可见单克隆形成，表明GFP基因可整合到细胞的染色体 中表达，随着宿主细胞的分裂而扩增。HPLC检测结果表明，rAAV－TH 或rAAV－GDNP感染体外培养的MNgD细胞后，可增加其DA的产出量。 rAAV－TH和rAAV－GDNF感染体外培养的HBK－293细胞后，RT－PCR及 Western Blot结果证实其所表达的目的基因具有明确的生物学活 性。2．提前1周于大鼠黑质部位注射rAAV－GDNF，然后作内侧前脑束（MFB） 切断，1周后大鼠开始出现药物诱导的同向旋转行为，至4周达高峰， 此后旋转行为有轻度下降趋势，与对照组比较不明显。免疫组化染 色表明黑质DA神经元的数目较对照组显著增多。表明GDNF可保护 黑质DA能神经元胞体免于MPB切割损伤后的逆行性变性，但对纹状 体部位的DA纤维末梢顺行性变性无明显保护作用，对PD大鼠的行 为学及纹状体DA含量恢复暂时无明显效果。3．采用MFB切割损伤方法制作PD大鼠模型，在MFB损伤后1周，将 rAAV－TH以多点方式注射至大鼠的纹状体内，注射后第2周大鼠的旋 转行为开始出现恢复，至 12周后逐渐稳定，HPLC检测提示治疗组 DA的含量有明显恢复，但免疫组化染色显示黑质DA神经元数目仍明 显减少，纹状体内rAAV－TH注射部位周围可见TH免疫染色阳性细胞。4．双基因联合治疗组，首先于大鼠黑质部位注射rAAV－GDNF，l周后进 行MFB切断，第2周后再行纹状体内多点注射rAAV－TH，结果显示 rAAV－TH注射后第2周大鼠的旋转行为开始出现明显恢复，4周后即 下降至3转／min以下，其行为学和纹状体内DA含量恢复的速度和程 度明显优于单纯rAAV－TH治疗组，免疫组化染色证实黑质DA能神经 元胞体得以大部分保存。5．rAAV－GFP作为对照组注射至黑质或纹状体内，对MFB切割损伤大鼠 的行为学和DA含量的恢复均无明显作用，而且对DA神经元胞体也 未显示保护作用。6．rAAV载体能有效介导TH、GDNF及GFP等外源基因在叩大鼠脑内有—— －4－ j—，’“。＼——。、－—，／、。丫／／、·“”。／、／丫＊丫＊丫＊丫／＊丫丫、＜”。”y丫＊’，、—“卜． 效表达，具有明显的转基因生物学活性，而且未见有明显的毒副作 用，荧光显微镜观察证实，rAAV－GFP注射大鼠脑内6个月后，于注 射部位仍可见许多绿色荧光细胞，说明外源基因的表达时间至少存 在6个月以上。 7．在上述研究的基础上，为了更好地探索双基因联合表达的效果，以 达到在一个rAAV载体中同时有效地表达两个外源基因的设想。进一 步构建了通用型rAAV双表达载体质粒pAVIRES，并将荧光报告基因 EGFP 和 RF