论文部分内容阅读
目的(1)通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的原代培养、传代及冻存与复苏,以及含中药冠心康药物血清的制备,为进一步研究中药防治AS的机制提供充足的实验材料。(2)通过观察同型半胱氨酸对HUVEC的刺激作用,探讨Hcy诱导HUVEC细胞凋亡的作用机制。(3)观察冠心康药物血清干预Hcy作用的HUVEC后各项指标的变化,探讨中药冠心康防治Hcy致AS的作用机制。方法(1)应用胰酶消化法,将人脐静脉内皮细胞分离下来,并用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养,在细胞达到80%融合后,消化传代,并将获得的细胞进行鉴定与冻存;应用中药血清药理学的方法,制备含不同中药药物浓度的药物血清。(2)将获得的HUVEC随机分为6组,即为空白对照组、0.01mmol/L Hcy组、0.1mmol/L Hcy组、1.0mmol/L Hcy组、2.0mmol/L Hcy组、3.0mmol/L Hcy组,然后分别在3h、6h、12h、24h测定细胞的凋亡率、线粒体膜电位及作用24h时内质网伴侣蛋白Grp78蛋白表达水平的变化。(3)将获得的HUVEC随机分为5组,分别为:空白对照组、模型对照组、冠心康低浓度组、冠心康中浓度组、冠心康高浓度组;在冠心康作用2h后,每组细胞分别加入3.0 mmol/L的Hcy,分别作用3h、6h、12h和24h,观察血管内皮细胞的凋亡率、线粒体膜电位、Grp78蛋白表达水平的不同以及细胞内ROS和LOX-1蛋白表达的变化。结果(1)经过鉴定,证明获得的细胞为HUVEC,细胞生长状态良好,冻存复苏后的细胞其生长情况与未冻存的细胞无差别;并制备出含不同药物浓度的中药血清(。2)在0.1mmol/L Hcy作用6h后,细胞凋亡率明显升高,线粒体膜电位降低明显,其结果随Hcy浓度的增加、作用时间的延长而逐渐差异显著,与空白对照组比较有显著差异(P<0.05);Grp78的蛋白表达在0.1mmol/L开始表达上调,并呈浓度依赖性,于3.0mmol/L,达到高峰。(3)模型组细胞细胞凋亡率显著增高,线粒体膜电位下降显著,Grp78的蛋白表达明显上调,内皮细胞内ROS升高,LOX-1表达上调,与空白组比较有统计学意义(P<0.05);在中、高浓度的冠心康干预下,血管内皮细胞的细胞凋亡率显著下降,线粒体膜电位下降减低,Grp78的蛋白表达降低,ROS生成减少,LOX-1的蛋白表达下调,与模型组比较有显著差异(P<0.01),且随着作用时间的延长,作用越显著。结论(1)应用酶消化法,可以获得HUVEC,并可以通过技术将其进行冻存与复苏;应用血清药理学的原理,能制备含不同浓度的中药药物血清,为进一步研究打下基础。(2)Hcy能够诱导血管内皮细胞凋亡及Grp78蛋白水平的表达上调,其结果呈浓度、作用时间依赖性,说明其作用机制可能是引起内质网应激,促进内质网内未折叠蛋白堆积,内质网伴侣蛋白表达上调所致。(3)冠心康能够拮抗同型半胱氨酸对血管内皮细胞的损伤作用,且与冠心康的浓度、作用时间呈正性依赖关系;其作用机制可能是冠心康通过抑制同型半胱氨酸诱导的内质网应激,从而降低内皮细胞的凋亡率,减少细胞内ROS的产生,减轻同型半胱氨酸所致的脂质代谢紊乱而实现的。