肥胖以及由于肥胖引起的一系列相关性疾病,如II型糖尿病、心脑血管疾病、癌症等已经成为世界性关注的问题[1]。肥胖过程中脂质代谢紊乱是其最根本的原因之一,而代谢综合征的最基本环节是脂质代谢紊乱[2]。脂质代谢紊乱是由于内外环境因素所致的脂质代谢产物表达量或者分布异常的现象[3]。大量研究证实,在脂质代谢的过程中,血液中游离脂肪酸含量增加,脂肪酸转运酶(FAT/CD36)作为脂肪酸重要代谢酶之一,在多种组织细胞均有广泛分布,在很多的肥胖和炎症模型中都可检测到FAT/CD36表达量的改变,然而对于FAT/CD36表达量改变的机制以及其在孕期炎症所致肥胖中的具体机制尚不明确[4]。在炎症反应中,炎症免疫因子PTX3是人体固有体液免疫中的一个重要组成成分,主要通过与C1q和H因子相互作用,激活和调节补体级联反应,发挥免疫调节作用,在抵抗特异性微生物以及调控炎症方面发挥重要作用[5]。近几年,PTX3与肥胖和炎症之间的关系研究越来越深入,肥胖是一种慢性低丰度炎症已经成为一个公认的事实[6]。然而炎症是否会直接引起肥胖却鲜少报道,大量实验证明,很多慢性病的起因要追溯到生命的早期,宫内炎症引起子代代谢性疾病与肥胖作为一种独立因素,在肥胖的发病机制中至关重要[7];在以往的大多数炎症与肥胖模型中,都是通过小鼠后天的炎症刺激或饮食诱导,因后天人为因素干预,故较难反应动物自然生长状态下炎症的真实情况,而我们的模型选择对母代孕鼠进行炎症刺激,研究子代小鼠的发育与代谢状况,去探讨肥胖的发生与炎症的关系,因未对子代小鼠做任何人为干预,故更能自然、贴切的反应机体慢性炎症状态下,小鼠发生代谢性疾病的真实状况,通过我们科室前期的研究已经发现,孕期一次性LPS刺激会导致子代小鼠出现肥胖[7,8],然而其具体的机制尚不清楚,所以本论文从脂肪代谢调节因子FAT/CD36与炎症免疫因子PTX3的角度出发,去探讨炎症和肥胖之间的通路调节机制,以期为炎症与肥胖之间的关系做进一步的研究。方法:1.孕期炎症刺激对子代小鼠脂肪发育、脂质代谢及FAT/CD36表达量的影响1.1从第三军医大学动物房购买C57小鼠于SPF级环境下正常饲养至8周龄,雌鼠体重(20±2)g,雄鼠体重(25±2)g,于第一天下午18:00按照雌:雄=2:1的比例同笼配种,第二天早上7:00分笼饲养,并记录各笼小鼠体重,记为在孕0天,于第十一天时称量孕鼠体重,若与在孕0天相比,体重增加大于2g且观察小鼠腹部出现明显隆起,则确定怀孕。1.2将确定怀孕的孕鼠随机分为2组,对照组NS:在孕第11天腹腔一次性注射无菌生理盐水0.2ml;LPS组:在孕第11天一次性腹腔注射LPS 75μg.kg-1,怀孕以后取子代小鼠作为研究对象,构建孕期炎症子代小鼠模型。1.3两组子代小鼠从出生开始(设为第0天)进行体重监测,每2w测量一次体重(g)直到12w并于4w、8w和12w分别取样,称取脂肪湿重(g),并计算脂肪系数(脂肪系数=脂肪湿重/体重×100),测量母体孕期炎症刺激对子代小鼠脂肪发育的影响。1.4通过眼球取血,分别在4w、8w和12w时获取子代雄鼠的血液样本,通过试剂盒分别检测雄鼠血液中游离脂肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)含量。1.5子代雄鼠于4w、8w和12w取雄鼠附睾脂肪组织,通过试剂盒分别检测雄鼠脂肪组织中游离脂肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)含量。1.6 Real-time PCR法和Western Blot方法分别检测子代雄鼠附睾脂肪中FAT/CD36 m RNA表达水平和蛋白的表达水平。1.7 Real-time PCR检测诱导分化3T3-L1细胞中m RNA表达水平和Western Blot法检测诱导分化3T3-L1细胞中FAT/CD36含量的蛋白表达水平。2.孕期炎症刺激对子代小鼠肥胖的机制研究2.1子代雄鼠于4W、8W和12W取附睾脂肪组织,通过通过Real-time PCR法和Western Blot方法检测PTX3 m RNA和蛋白水平表达量。2.2 Real-time PCR法和Western Blot方法分别检测子代雄鼠附睾脂肪组织中脂肪分化标志物(a P2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)m RNA水平和蛋白水平表达量。2.3转染si RNA和过表达PTX3质粒对3T3-L1细胞中PTX3、脂肪分化标志物(a P2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)m RNA水平和脂肪分化标志物蛋白水平表达量影响。2.4流式细胞技术检测转染si RNA和过表达PTX3质粒对3T3-L1细胞凋亡的影响。2.5 MTT法检测转染si RNA和过表达PTX3质粒对3T3-L1细胞的增殖的影响。2.6油红染色检测转染si RNA和过表达PTX3质粒对3T3-L1细胞分化的影响。2.7 Western Blot方法检测子代雄鼠附睾脂肪组织中MAPK通路相关蛋白的相对表达量。结果:1.孕期炎症刺激对子代小鼠脂肪发育的影响1.1与NS组相比,LPS组各周龄雄鼠体重、附睾脂肪湿重及4W、8W附睾脂肪系数均增加,差异具有显著性(p<0.05)(Fig.1-3);8W、12W子代雌鼠体重、4W、8W、12W子代雌鼠肾周脂肪湿重及8W、12W肾周脂肪系数均增加,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.1-3)。1.2与NS组相比,LPS组4w、8w、12w子代雄鼠血液中的FFA表达量显著增高,差异具有统计学(p<0.05)(Fig.4A);LPS组子代雄鼠血液中8w、12w TG含量显著增高,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.4B)。1.3与NS组相比,LPS组4w、8w、12w子代雄鼠脂肪组织中的FFA含量显著增加,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.5A);LPS组子代雄鼠脂肪组织中8w、12w TG含量显著增加,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.5B)。1.4与NS组相比,LPS组子代雄鼠附睾脂肪组织中FAT/CD36 m RNA水平表达量显著增加,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.6);LPS组雄鼠附睾脂肪组织中4w、8w FAT/CD36蛋白水平表达量显著增加,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.7)。1.5与正常组相比;诱导的3T3-L1细胞中FAT/CD36 m RNA水平表达量显著增加,差异具有统计学意义(p<0.01)(Fig.8);诱导的3T3-L1细胞中FAT/CD36蛋白水平表达量显著增加,差异具有统计学意义(p<0.01)(Fig.9)。2.孕期炎症刺激对子代小鼠肥胖的机制研究2.1与NS组相比,LPS组PTX3 m RNA水平和蛋白水平表达量均显著升高(p<0.05)(Fig.10)。2.2与NS组相比,4W CEBP/α、CEBP/β、PPARγ和8W CEBP/α、PPARγ以及12W CEBP/β、a P2、PPARγ子代小鼠脂肪分化标志物m RNA水平和蛋白水平表达量均显著升高(p<0.05)(Fig.11)。2.3在转染si RNA的3T3-L1细胞中,与NS组相比,炎症因子PTX3、脂肪分化标志物(CEBP/α、a P2)的表达量显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.12);在过表达PTX3质粒的细胞中,与Control组相比,过表达PTX3质粒的3T3-L1前脂肪细胞脂肪分化标志物(a P2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)表达量显著升高,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.12)。2.4与NS组组相比,过表达组对3T3-L1细胞凋亡没有显著影响,抑制表达PTX3显著降低3T3-L1细胞的凋亡(p<0.05)(Fig.13A)。2.5与NS组相比,过表达组与抑制表达组对3T3-L1细胞周期没有显著影响(p>0.05)(Fig.13B)。2.6油红染色的结果显示,过表达PTX3组中,细胞的分化为成熟细胞的程度和数量显著增加,抑制表达组细胞的分化程度和数量显著减少,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.13C)。2.7与对照组相比,过表达组与抑制表达组对3T3-L1细胞的增殖没有显著影响(p>0.05)(Fig.13D)。2.8与NS组相比,LPS组子代雄鼠脂肪组织中的非磷酸化MAPK(P38、JNK、ERK1/2)相关蛋白4W ERK1/2(P42/P44)、JNK/SNPK(P46/P54)、8W ERK1/2(P42/P44)以及12W JNK/SNPK(P46/P54)含量显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)(Fig.14A-C);磷酸化MAPK(p-P38、p-JNK/SNPK、p-ERK1/2)相关蛋白p-P38、p-JNK/SNPK(p-P42/P44)、p-ERK1/2(p-P46/P54)含量显著升高(p<0.05)(Fig.14D-F)。结论1.在给予母代孕鼠一次性孕期LPS炎症刺激以后,子代小鼠出现了以体重增加、脂肪湿重增加、脂肪系数变大且血液中和脂肪组织中FFA和TG含量异常增多的脂质代谢紊乱现象,并且在诱导分化的3T3-L1细胞中,FAT/CD36的表达量较正常组也显著升高,提示在孕期炎症导致子代小鼠脂质代谢紊乱过程中,FAT/CD36具有重要的作用。2.通过给予母代小鼠一次性LPS刺激,建立的炎症与肥胖模型研究展示孕期炎症刺激导致子代小鼠中PTX3含量显著增加,高表达的PTX3通过正向调节脂肪分化标志物的表达量促进脂肪细胞的形成增加,最终导致肥胖的发生。3.MAPK通路的过度活化可能在PTX3上调节脂肪分化标志物,增加肥胖易感性中具有重要作用。