脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,在所有的颅内肿瘤中胶质瘤的发生率约占40～50%。脑胶质细胞瘤的恶性生物学特性(如过度增殖、极强的侵袭性、对抗凋亡等等)使其治疗非常困难。尽管现在脑胶质细胞瘤的治疗方法在不断地改善,但其疗效仍没有得到显著提高。以多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)为例,即使采用手术、放疗、化疗相结合的综合治疗方案,患者的平均生存期也往往不足一年。因此,发现脑胶质细胞瘤具有诊断和治疗意义的分子靶点对于改善其恶性生物学行为从而攻克这一疾病有着重要的科学意义和临床应用价值。Wnt/β-catenin信号转导通路是一个保守性很强的信号通路,它调节控制了许多生命过程。在高等动物的胚胎发育过程中它主要参与细胞的增殖、分化、极化、凋亡等过程。Wnt/β-catenin信号转导通路的异常与许多人类疾病密切相关,包括肿瘤、骨质疏松、衰老和退行性疾病等。作为神经系统发育的重要调节因子,Wnt/β-catenin信号转导通路几乎参与神经发育过程的所有阶段,包括干细胞的增殖、维持和分化。近期研究表明,Wnt/β-catenin信号转导通路促进脑胶质细胞瘤的形成,并且该通路中的一些蛋白在脑胶质细胞瘤中异常表达。FRAT1是Wnt/β-catenin信号转导通路的正向调节因子。它通过与GSK3相结合,抑制GSK3对β-catenin的磷酸化,使胞浆内游离的β-catenin水平升高,β-catenin继而进入胞核,与TCF/LEF家族结合而激活c-myc,cyclinD1等一系列癌基因的表达,引起细胞异常增殖,最终致使细胞发生癌变。研究发现,FRAT1在许多肿瘤(包括食道癌、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等)都出现高表达并参与其恶性行为,是一个在肿瘤的增殖和侵袭中有着重要作用的基因。但目前尚未见有关该基因与脑胶质细胞瘤相关性研究的报道。FRAT1能否成为有价值的脑胶质细胞瘤治疗靶点尚需要进一步的研究证实。基于此,本课题从以下四个方面进行了研究。1、FRAT1基因在人脑胶质细胞瘤中的表达及意义:本部分实验首先采用免疫组化方法检测了FRAT1蛋白在84例人脑胶质细胞瘤组织和6例正常人脑组织及三株人脑胶质瘤细胞系(U251、U87和SHG-44)中的表达水平。结果显示,人脑胶质细胞瘤组织中FRAT1蛋白表达阳性率为66.7%,而正常人脑组织未见FRAT1蛋白表达。胶质瘤组织FRAT1蛋白免疫反应评分(immunoreactivity score,IRS)为4.07±3.60,与正常人脑组织有显著差异(P<0.01)。FRAT1 IRS在脑胶质细胞瘤不同病理级别之间存在显著差异(F=12.31,p<0.01),并且FRAT1 IRS随着脑胶质细胞瘤病理级别的增高而显著升高(r=0.55,p<0.01);FRAT1蛋白在U251、U87和SHG-44三种胶质瘤细胞系中均有表达,在U251细胞中表达水平较高。接着采用免疫组化方法检测了Ki67蛋白在脑胶质细胞瘤组织中的表达,采用荧光TUNEL法检测了脑胶质细胞瘤组织中细胞凋亡水平,并且计算了脑胶质细胞瘤增殖指数(proliferative index,PI)和凋亡指数(apoptotic index,AI)。结果表明所有胶质瘤组织中均有Ki67表达。PI为(31.69±19.96)%,它随着脑胶质细胞瘤病理级别的升高而增高(P <0.01)。FRAT1蛋白阳性组PI明显高于阴性组(P <0.01),且PI与FRAT1 IRS呈显著正相关(P<0.01)。所有胶质瘤组织中均可见凋亡细胞,AI为(2.75±1.73)%,它随着脑胶质细胞瘤病理级别的升高而增高(P <0.01)。FRAT1蛋白阳性组和阴性组AI虽然没有显著差异(P>0.05),但AI与FRAT1 IRS呈显著负相关(P<0.05)。然后采用RT-PCR和Western blot检测了FRAT1 mRNA和蛋白在脑胶质细胞瘤组织中的表达情况。结果表明,FRAT1 mRNA和蛋白在不同病理级别的脑胶质细胞瘤中均有表达。而正常人脑组织均未见FRAT1 mRNA和蛋白表达。FRAT1 mRNA和蛋白的表达强度随胶质瘤组织病理级别升高而增高(P均<0.01)。最后采用RT-PCR和Western blot检测了FRAT1 mRNA和蛋白在三株人脑胶质瘤细胞系(U251、U87和SHG-44)中的表达水平。结果表明,FRAT1在胶质瘤细胞系U251、U87和SHG-44中均有表达,在U251细胞中表达水平较高。本部分研究发现FRAT1 mRNA和蛋白在脑胶质细胞瘤组织和细胞系中高表达,其表达水平随胶质瘤病理级别的升高而增高;而且FRAT1蛋白表达与肿瘤增殖呈正相关、与肿瘤凋亡呈负相关。2、稳定整合FRAT1基因RNA干涉载体的胶质瘤细胞系的建立:这部分实验选取了胶质瘤细胞系U251为研究对象,根据FRAT1基因序列,设计并合成了针对FRAT1 mRNA的特异性RNAi片段,将其克隆入pRNAT-U6.1/Neo载体,从而构建了FRAT1 shRNA真核干涉表达载体pRNAT-FRAT1,经测序鉴定证实克隆正确。采用脂质体介导法将所构建的载体pRNAT-FRAT1和空载体pRNAT-U6.1/Neo及阴性对照载体pRNAT-NC分别转染U251细胞,经G418筛选后,得到了稳定转染细胞系U251-S(FRAT1干涉载体组)、U251-neo(空载体组)和U251-NC(阴性对照载体组)。随后使用RT-PCR和Western blot检测了U251-S、U251-neo和U251-NC细胞中FRAT1 mRNA和蛋白表达水平。结果表明,U251-S细胞中FRAT1 mRNA和蛋白的表达受到明显抑制,而U251-neo和U251-NC细胞中FRAT1 mRNA和蛋白表达水平跟未转染的U251细胞相比无明显变化。本部分研究成功地构建了FRAT1基因RNA干涉载体,并成功获得了稳定下调FRAT1表达的胶质瘤细胞系U251-S,为下一步研究FRAT1表达对胶质瘤细胞生物学特性的影响提供了良好的细胞模型并奠定了实验基础。3、FRAT1基因RNAi对脑胶质瘤细胞体外增殖及侵袭的影响:本部分实验针对U251-S(FRAT1干涉载体组)、U251-neo(空载体组)、U251-NC(阴性对照载体组)和U251(未转染组)四组细胞进行。首先MTT法绘制细胞生长曲线显示U251-S细胞与其他各组相比生长明显减缓(P<0.01)。平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验显示U251-S细胞较其他组细胞克隆形成数量明显减少(P<0.01)。接着流式细胞术检测细胞周期显示U251-S细胞与其他细胞相比,G0/G1期细胞明显增多,G2/M期细胞明显减少(p<0.01)。然后单层细胞划痕实验显示U251-S细胞的迁移能力较其他各组细胞明显降低(p<0.01)。最后Transwell侵袭小室实验显示U251-S细胞穿过基质胶的数量明显低于其他各组细胞(p<0.01)。本部分研究表明,FRAT1基因对胶质瘤细胞周期有重要影响,而且下调FRAT1基因的表达能够明显地抑制胶质瘤细胞的体外增殖、侵袭和迁移能力。4、FRAT1基因RNAi对脑胶质瘤细胞裸鼠体内成瘤、增殖和侵袭的影响:本部分实验将U251-S、U251-neo、U251-NC和U251细胞分别接种于裸鼠背部皮下,定期测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。观察40d后处死裸鼠,称瘤重后取瘤组织行FRAT1免疫组化染色。结果显示,与U251、U251-neo和U251-NC组相比,U251-S细胞在裸鼠体内的成瘤能力和该组移植瘤生长速度明显降低(p<0.01),肿瘤体积及瘤重较其他各组细胞所成肿瘤均明显减小(P <0.01),而且U251-S组肿瘤组织FRAT1蛋白表达与其他各组肿瘤相比明显下降。本部分研究提示,FRAT1基因RNAi能够明显抑制脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的形成和生长,进一步证实了下调FRAT1基因的表达可以抑制脑胶质瘤细胞的体内增殖和侵袭能力。综上所述,FRAT1高表达可能与脑胶质细胞瘤的恶性增殖、侵袭和抗凋亡等生物学特性密切相关。本研究结果不仅为Wnt/β-catenin信号转导通路的研究开辟了新的领域,也为脑胶质细胞瘤病理诊断和基因治疗提供了新的靶点。