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细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)在苏氨酸/丝氨酸残基上发生磷酸化形成活化形式的ERK1/2(p-ERK1/2)。该磷酸化及其下游的信号转导通路在神经元发育过程中具有重要意义。在成熟脑内,ERK1/2的磷酸化与记忆形成和突触可塑性密切相关。
高同型半胱氨酸血症与血管疾病,认知功能障碍,神经系统病变等有关,目前正在引起人们越来越多的关注。正常人同型半胱氨酸血浆浓度为10 μM以下,随着年龄的增长有轻度升高的现象,同型半胱氨酸是必需氨基酸蛋氨酸的代谢产物,又可在蛋氨酸合成酶的作用下,重新甲基化为蛋氨酸,此过程需叶酸或维生素B12的参与。
在体内外试验中,暴露在不同浓度的同型半胱氨酸可引起细胞死亡。而同型半胱氨酸的毒性机制可能是刺激NMDA型谷氨酸受体和亲代谢型谷氨酸受体引起。另外,Robert发现在海马切片,100 μM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化可被NMDA、非NMDA和代谢型谷氨酸受体拮抗剂所抑制,表明谷氨酸释放参与此过程。
本试验中,微摩尔浓度的同型半胱氨酸在原代培养的小脑颗粒神经元通过上皮生长因子受体(EGFR)间接激活途径引起ER-K1/2磷酸化。在EGFR间接激活中,Gq或Gi/o蛋白耦联受体激活或细胞内游离钙离子浓度升高,均可导致金属蛋白酶催化的EGFR配体释放,EGFR在脑内广泛存在。但在无必需氨基酸的盐溶液中孵育时,只有毫摩尔量的同型半胱氨酸才能引起ERK1/2磷酸化,且该磷酸化过程不依赖于间接激活。微摩尔量的同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化需要谷氨酸前体谷氨酰胺存在。这些研究表明,微摩尔浓度同型半胱氨酸产生效应过程中可能存在Xc-转运体参与。同型半胱氨酸通过Xc-转运体与胱氨酸/谷氨酸交换,引起局部同型半胱氨酸浓度增高。
谷氨酸/胱氨酸转运体又称为Xc-系统,在Xc-系统作用下,细胞释放1分子的谷氨酸,并摄取1分子胱氨酸入胞,两者形成耦联转运。胱氨酸在胞内迅速被还原成半胱氨酸,一部分参与胞内重要自由基清除剂谷胱甘肽的合成,另一部分则出胞氧化成胱氨酸,重新参与Xc-系统循环。
金属蛋白酶对调节细胞微环境起重要作用,通过参与细胞外基质降解而影响细胞迁移、分化、增殖和存活。目前关于金属蛋白酶在脑内的表达是研究的热点。本课题组曾报道,在星形胶质细胞,金属蛋白酶参与EGFR间接激活途径,而与EGFR间接激活有关的金属蛋白酶为基质金属蛋白酶(MMP),含去整合素域和金属蛋白酶域的蛋白酶(ADAM)。本篇文章主要研究Xc-转运体和金属蛋白酶在小脑颗粒神经元同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化中的作用。即：(1)阐明同型半胱氨酸引起小脑颗粒神经元上皮生长因子受体间接激活的信号转导途径。(2)研究System Xc-系统是否参与同型半胱氨酸引起小脑颗粒神经元ERK1/2磷酸化的过程。(3)神经元和星形胶质细胞上存在的MMP和ADAM类型。(4)参与神经细胞上皮生长因子受体间接激活信号转导途径的金属蛋白酶类型。
方法:
采用原代培养的小脑颗粒神经元。将细胞在37℃无血清相关培养液中孵育20分钟,含有不同浓度的同型半胱氨酸以及相关特异性抑制剂。应用冰PBS洗涤细胞,加入裂解液,终止反应,收集细胞。进行凝胶电泳,免疫印迹分析。使用SPSS12.0软件进行统计学分析,多组资料用one-way ANOVA方法进行比较,P<0.05表示差异具有统计学意义。
结果：
1、同型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化呈时间和浓度依赖性。
将细胞在培养液(含必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺、200 μM胱氨酸)中孵育20分钟。在同型半胱氨酸浓度为100 μM及大于100 μM时,磷酸化水平开始升高。曲线表明同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化是浓度依赖性的,而球100 μM和1 mM同型半胱氨酸作用在细胞10分钟后,p-ERK1/2开始升高,两者均是在20分钟时升高最为显著且具有统计学意义,在40分钟时下降。
2、EGFR(酪氨酸激酶受体)和锌依赖的金属蛋白酶参与同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。
AG1478为上皮生长因子受体特异性抑制剂,GM6001为金属蛋白酶抑制剂。二者均可抑制同型半胱氨酸20分钟时引起的ERK1/2磷酸化增加,说明此过程为EGFR间接激活途径,并NEGFR间接激活是依赖于金属蛋白酶裂解EGF受体的配体脱落进而激活EGFR。
3、NMDA和非NMDA受体参与同型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化。
MK801为NMDA受体拮抗剂,CNQX为非NMDA受体拈抗剂,二者均可完全阻断100 μM同型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化,而对1 mM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化抑制程度不完全,提示1 mM同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化过程中可能存在其他信号传导途径。
4、在不含必需氨基酸的PBS中,代谢型谷氨酸受体参与毫摩尔浓度同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。
上述实验均在含必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺和200μM胱氨酸条件下得到。但在不含必需氨基酸的PBS中,1 mM同型胱氨酸并不引起ERK1/2磷酸化,2 mM同型半胱氨酸开始引起ERK1/2磷酸化,并且有统计学意义,在10 mM-15 mM时达到最大。AG1478、GM6001、MK801和CNQX均不能抑制ERK1/2的磷酸化,但是,10 mMN型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化可以被mGluR1抑制剂LY367385和mGluR5抑制剂MPEP所抑制。
5、同型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化可被DIDS和SPAP抑制。
我们用Xc-转运体抑制剂100 μM DIDS、300 μM SPAP来检测Xc-转运体是否参与同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。结果两种抑制剂均可阻断ERK1/2磷酸化,表明ERK磷酸化依赖于Xc-转运体。
6、MMP和ADAM在小脑颗粒神经元和星形胶质细胞上的表达。
我们用逆转录聚合酶链反应检测MMP和ADAM在小脑颗粒神经元和星形胶质细胞的表达,发现存在15种表达。其中,与脑组织相比,在星形胶质细胞,MMP15、MMP24、MMP25表达减少,而MMP9在神经元表达减少。
讨论：
1、微摩尔和毫摩尔浓度同型半胱氨酸作用的比较
NMDA和非NMDA受体拮抗剂均可完全阻断100 μM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化,表明NMDA和非NMDA受体相继激活,上述反应要求介质中谷氨酰胺存在。而当无谷氨酰胺存在时需要十倍浓度的同型半胱氨酸才能引起反应。在此条件下,ERK1/2磷酸化不依赖于间接激活,离子型谷氨酸受体拈抗剂不能抑制ERK1/2磷酸化,但是代谢型谷氨酸受体mGluR1和mGluR5抑制剂确能阻断此反应。
2、谷氨酰胺和Xc-转运体的作用
微摩尔浓度同型半胱氨酸诱导ERK1/2磷酸化需要谷氨酸前体谷氨酰胺的存在,表明Xc-转运体可能参与此过程,用Xc-转运体抑制剂DIDS和SPAP可抑制反应证实了这一点。Xc-转运体在生理上是细胞内的谷氨酸和细胞外的胱氨酸转运体。使君子氨酸既是Xc-转运体的底物,又是非NMDA受体激动剂。而且,使君子氨酸可以“自我敏感化”。因为同型半胱氨酸既是谷氨酸受体激动剂而且可与Xc-转运体作用,因此我们猜测同型半胱氨酸也有类似的“自我致敏”作用,而且上述实验结果也与此相符。
在小脑颗粒神经元内谷氨酰胺酶作用下,谷氨酰胺可代谢为谷氨酸,细胞外液中含有一定浓度的谷氨酰胺时可以激活Xc-转运体,使细胞外谷氨酸与细胞内累积得同型半胱氨酸交换。
3、同型半胱氨酸的神经毒性作用
体内同型半胱氨酸的神经毒性作用很可能是因为微摩尔浓度的同型半胱氨酸激活离子型受体所致。目前研究揭示胱氨酸/谷氨酸交换体介导的“自我致敏”作用在临床相关浓度同型半胱氨酸的神经毒性中起重要作用。提示我们转运体抑制剂可能对高同型半胱氨酸血症有神经保护作用。Ferrer等人研究证明ERK1/2磷酸化可对抗兴奋性中毒而起神经保护作用。
4、金属蛋白酶在星形胶质细胞和神经元的表达及其在EGFR间接激活中的作用
有人利用核糖核酸酶保护测定发现在成年小鼠脑内存在低水平的MMP2、MMP9、MMP1、MMP12、MMP14表达,但我们却发现MMP2和MMP9在小鼠脑内表达水平比较高。ADAMs已被证明在多种动物脑内存在,而IivariKarkkainen等人证实其在小鼠脑内的存在。另外,我们发现在小鼠脑内存在15种Mps表达,并且与脑组织相比,在星形胶质细胞,MMP15、MMP24、MMP25表达减少,而MMP9在神经元表达减少。组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)对MT-MMPs几乎无抑制作用,而TIMP-2则可以抑制全部MMP。因此,我们可以应用TIMP-1和TIMP-2来检测MT-MMP是否参与蛋白酶裂解。许多研究表明,ADAM家族成员参与膜锚定蛋白外功能区脱落进而引起生理功能的改变。但有趣的是,我们在实验中发现ADAM17参与KC1引起星形胶质细胞ERK1/2磷酸化,但KC1引起小脑颗粒神经元ERK1/2磷酸化却不需要ADAM17参与。
结论：
1、同型半胱氨酸通过EGFR间接激活及Xc-转运体的自我致敏作用在小脑颗粒神经元引起ERK1/2的磷酸化。
2、15种金属蛋白酶在星形胶质细胞和小脑颗粒神经元均有表达。
高同型半胱氨酸血症与血管疾病,认知功能障碍,神经系统病变等有关,目前正在引起人们越来越多的关注。正常人同型半胱氨酸血浆浓度为10 μM以下,随着年龄的增长有轻度升高的现象,同型半胱氨酸是必需氨基酸蛋氨酸的代谢产物,又可在蛋氨酸合成酶的作用下,重新甲基化为蛋氨酸,此过程需叶酸或维生素B12的参与。
在体内外试验中,暴露在不同浓度的同型半胱氨酸可引起细胞死亡。而同型半胱氨酸的毒性机制可能是刺激NMDA型谷氨酸受体和亲代谢型谷氨酸受体引起。另外,Robert发现在海马切片,100 μM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化可被NMDA、非NMDA和代谢型谷氨酸受体拮抗剂所抑制,表明谷氨酸释放参与此过程。
本试验中,微摩尔浓度的同型半胱氨酸在原代培养的小脑颗粒神经元通过上皮生长因子受体(EGFR)间接激活途径引起ER-K1/2磷酸化。在EGFR间接激活中,Gq或Gi/o蛋白耦联受体激活或细胞内游离钙离子浓度升高,均可导致金属蛋白酶催化的EGFR配体释放,EGFR在脑内广泛存在。但在无必需氨基酸的盐溶液中孵育时,只有毫摩尔量的同型半胱氨酸才能引起ERK1/2磷酸化,且该磷酸化过程不依赖于间接激活。微摩尔量的同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化需要谷氨酸前体谷氨酰胺存在。这些研究表明,微摩尔浓度同型半胱氨酸产生效应过程中可能存在Xc-转运体参与。同型半胱氨酸通过Xc-转运体与胱氨酸/谷氨酸交换,引起局部同型半胱氨酸浓度增高。
谷氨酸/胱氨酸转运体又称为Xc-系统,在Xc-系统作用下,细胞释放1分子的谷氨酸,并摄取1分子胱氨酸入胞,两者形成耦联转运。胱氨酸在胞内迅速被还原成半胱氨酸,一部分参与胞内重要自由基清除剂谷胱甘肽的合成,另一部分则出胞氧化成胱氨酸,重新参与Xc-系统循环。
金属蛋白酶对调节细胞微环境起重要作用,通过参与细胞外基质降解而影响细胞迁移、分化、增殖和存活。目前关于金属蛋白酶在脑内的表达是研究的热点。本课题组曾报道,在星形胶质细胞,金属蛋白酶参与EGFR间接激活途径,而与EGFR间接激活有关的金属蛋白酶为基质金属蛋白酶(MMP),含去整合素域和金属蛋白酶域的蛋白酶(ADAM)。本篇文章主要研究Xc-转运体和金属蛋白酶在小脑颗粒神经元同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化中的作用。即：(1)阐明同型半胱氨酸引起小脑颗粒神经元上皮生长因子受体间接激活的信号转导途径。(2)研究System Xc-系统是否参与同型半胱氨酸引起小脑颗粒神经元ERK1/2磷酸化的过程。(3)神经元和星形胶质细胞上存在的MMP和ADAM类型。(4)参与神经细胞上皮生长因子受体间接激活信号转导途径的金属蛋白酶类型。
方法:
采用原代培养的小脑颗粒神经元。将细胞在37℃无血清相关培养液中孵育20分钟,含有不同浓度的同型半胱氨酸以及相关特异性抑制剂。应用冰PBS洗涤细胞,加入裂解液,终止反应,收集细胞。进行凝胶电泳,免疫印迹分析。使用SPSS12.0软件进行统计学分析,多组资料用one-way ANOVA方法进行比较,P<0.05表示差异具有统计学意义。
结果：
1、同型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化呈时间和浓度依赖性。
将细胞在培养液(含必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺、200 μM胱氨酸)中孵育20分钟。在同型半胱氨酸浓度为100 μM及大于100 μM时,磷酸化水平开始升高。曲线表明同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化是浓度依赖性的,而球100 μM和1 mM同型半胱氨酸作用在细胞10分钟后,p-ERK1/2开始升高,两者均是在20分钟时升高最为显著且具有统计学意义,在40分钟时下降。
2、EGFR(酪氨酸激酶受体)和锌依赖的金属蛋白酶参与同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。
AG1478为上皮生长因子受体特异性抑制剂,GM6001为金属蛋白酶抑制剂。二者均可抑制同型半胱氨酸20分钟时引起的ERK1/2磷酸化增加,说明此过程为EGFR间接激活途径,并NEGFR间接激活是依赖于金属蛋白酶裂解EGF受体的配体脱落进而激活EGFR。
3、NMDA和非NMDA受体参与同型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化。
MK801为NMDA受体拮抗剂,CNQX为非NMDA受体拈抗剂,二者均可完全阻断100 μM同型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化,而对1 mM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化抑制程度不完全,提示1 mM同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化过程中可能存在其他信号传导途径。
4、在不含必需氨基酸的PBS中,代谢型谷氨酸受体参与毫摩尔浓度同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。
上述实验均在含必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺和200μM胱氨酸条件下得到。但在不含必需氨基酸的PBS中,1 mM同型胱氨酸并不引起ERK1/2磷酸化,2 mM同型半胱氨酸开始引起ERK1/2磷酸化,并且有统计学意义,在10 mM-15 mM时达到最大。AG1478、GM6001、MK801和CNQX均不能抑制ERK1/2的磷酸化,但是,10 mMN型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化可以被mGluR1抑制剂LY367385和mGluR5抑制剂MPEP所抑制。
5、同型半胱氨酸诱导的ERK1/2磷酸化可被DIDS和SPAP抑制。
我们用Xc-转运体抑制剂100 μM DIDS、300 μM SPAP来检测Xc-转运体是否参与同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化。结果两种抑制剂均可阻断ERK1/2磷酸化,表明ERK磷酸化依赖于Xc-转运体。
6、MMP和ADAM在小脑颗粒神经元和星形胶质细胞上的表达。
我们用逆转录聚合酶链反应检测MMP和ADAM在小脑颗粒神经元和星形胶质细胞的表达,发现存在15种表达。其中,与脑组织相比,在星形胶质细胞,MMP15、MMP24、MMP25表达减少,而MMP9在神经元表达减少。
讨论：
1、微摩尔和毫摩尔浓度同型半胱氨酸作用的比较
NMDA和非NMDA受体拮抗剂均可完全阻断100 μM同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化,表明NMDA和非NMDA受体相继激活,上述反应要求介质中谷氨酰胺存在。而当无谷氨酰胺存在时需要十倍浓度的同型半胱氨酸才能引起反应。在此条件下,ERK1/2磷酸化不依赖于间接激活,离子型谷氨酸受体拈抗剂不能抑制ERK1/2磷酸化,但是代谢型谷氨酸受体mGluR1和mGluR5抑制剂确能阻断此反应。
2、谷氨酰胺和Xc-转运体的作用
微摩尔浓度同型半胱氨酸诱导ERK1/2磷酸化需要谷氨酸前体谷氨酰胺的存在,表明Xc-转运体可能参与此过程,用Xc-转运体抑制剂DIDS和SPAP可抑制反应证实了这一点。Xc-转运体在生理上是细胞内的谷氨酸和细胞外的胱氨酸转运体。使君子氨酸既是Xc-转运体的底物,又是非NMDA受体激动剂。而且,使君子氨酸可以“自我敏感化”。因为同型半胱氨酸既是谷氨酸受体激动剂而且可与Xc-转运体作用,因此我们猜测同型半胱氨酸也有类似的“自我致敏”作用,而且上述实验结果也与此相符。
在小脑颗粒神经元内谷氨酰胺酶作用下,谷氨酰胺可代谢为谷氨酸,细胞外液中含有一定浓度的谷氨酰胺时可以激活Xc-转运体,使细胞外谷氨酸与细胞内累积得同型半胱氨酸交换。
3、同型半胱氨酸的神经毒性作用
体内同型半胱氨酸的神经毒性作用很可能是因为微摩尔浓度的同型半胱氨酸激活离子型受体所致。目前研究揭示胱氨酸/谷氨酸交换体介导的“自我致敏”作用在临床相关浓度同型半胱氨酸的神经毒性中起重要作用。提示我们转运体抑制剂可能对高同型半胱氨酸血症有神经保护作用。Ferrer等人研究证明ERK1/2磷酸化可对抗兴奋性中毒而起神经保护作用。
4、金属蛋白酶在星形胶质细胞和神经元的表达及其在EGFR间接激活中的作用
有人利用核糖核酸酶保护测定发现在成年小鼠脑内存在低水平的MMP2、MMP9、MMP1、MMP12、MMP14表达,但我们却发现MMP2和MMP9在小鼠脑内表达水平比较高。ADAMs已被证明在多种动物脑内存在,而IivariKarkkainen等人证实其在小鼠脑内的存在。另外,我们发现在小鼠脑内存在15种Mps表达,并且与脑组织相比,在星形胶质细胞,MMP15、MMP24、MMP25表达减少,而MMP9在神经元表达减少。组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)对MT-MMPs几乎无抑制作用,而TIMP-2则可以抑制全部MMP。因此,我们可以应用TIMP-1和TIMP-2来检测MT-MMP是否参与蛋白酶裂解。许多研究表明,ADAM家族成员参与膜锚定蛋白外功能区脱落进而引起生理功能的改变。但有趣的是,我们在实验中发现ADAM17参与KC1引起星形胶质细胞ERK1/2磷酸化,但KC1引起小脑颗粒神经元ERK1/2磷酸化却不需要ADAM17参与。
结论：
1、同型半胱氨酸通过EGFR间接激活及Xc-转运体的自我致敏作用在小脑颗粒神经元引起ERK1/2的磷酸化。
2、15种金属蛋白酶在星形胶质细胞和小脑颗粒神经元均有表达。