Twist基因表达与肿瘤细胞转移、浸润和耐药性的相关性初探

来源 :泸州医学院 西南医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:candysan
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目的:应用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT—PCR)方法,检测转移能力不同的两种人乳腺癌细胞株MCF—7和MDA—MB—435S中twist基因的表达情况,应用MTT法检测以上两种细胞对紫杉醇的敏感性,探讨两种细胞株twist基因表达差异与其药物敏感性差异的相关性。应用免疫组化技术,检测人肾癌组织不同区域的Twist蛋白、多要耐药相关蛋白(multidrug resistance—associated protein,MRP)、P糖蛋白(P—gp)、肺耐药蛋白(lung resistance—related protein,LRP)、拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)表达情况,探讨Twist在肾癌组织中的表达情况,以及与几种耐药蛋白表达之间的相关性。 方法:①培养MCF—7和MDA—MB—435S细胞,总RNA提取试剂盒提取两种细胞的总RNA。经紫外分光光度计检测OD260/OD280的比值及两种细胞中总RNA的含量,计算出两种细胞RNA的浓度。10%的琼脂糖凝胶电泳检测提取得总RNA分子的完整性。采用逆转录试剂盒和随机引物将总RNA逆转录成cDNA,然后进行体外PCR扩增,以GAPDH基因为内参照进行标准化。应用凝胶成像系统、荧光化学发光分析仪和Quantity One软件进行分析。②培养的MCF—7和MDA—MB—435S细胞分别分为对照组、紫杉醇试验组,每组3复孔,各组细胞培养2d后,对照组更换培养基,试验组更换为含有紫杉醇的培养基,分别于加药物后6h、12h、24h、36h、48h和72h加入MTT,避光培养4h,然后倾去培养基,加入DMSO,水平振荡10min后于酶标仪检测吸光度。③收集的人肾癌组织经固定、脱水、浸蜡、包埋、常规4μm石蜡切片后,行Twist蛋白、MRP、P—gp、LRP、TOPOⅡ免疫组织化学染色。鼠抗人拓扑异构酶(TOPO)Ⅱα抗体滴度1:20、鼠抗人肺癌耐药蛋白(LRP)抗体滴度1:20、鼠抗人多药耐相关蛋白(MRP)抗体滴度1:50、鼠抗人P糖蛋白(P—gp)抗体滴度1:20、兔抗人Twist抗体滴度1:500。为排除肾组织中的生物素干扰,设置阴性对照。免疫组织化学染色后对结果进行图像分析。 结果:①RT—PCR结果显示:两种细胞中均有twist基因表达,但是Twist在具有高转移性MDA—MB—435S细胞中的表达高于在具有中等转移性MCF—7细胞中的表达(P<0.05);②MTT实验显示,紫杉醇对MDA—MB—43 SS细胞的抑制作用弱于对MCF—7细胞的抑制作用(P<0.05),提示MDA—MB—435S细胞对紫杉醇的敏感性弱于MCF—7细胞;随着药物作用时间的延长,紫杉醇对两种细胞的抑制作用均是逐渐增强,在36h达到高峰,随后紫杉醇对MCF—7细胞的抑制作用出现波动但无明显下降,而对MDA—MB—435S细胞的抑制作用却出现了明显的下降(P<0.05);③在肾癌组织边界区组,Twist蛋白、MRP、P—gp、LRP、TOPOⅡ均为阳性表达,而在肾癌组织中心组,Twist蛋白和P—gp的表达为阴性,MRP、LRP、TOPOⅡ蛋白在肿瘤中心仍为阳性表达,但MRP和TOPOⅡ两种蛋白在肿瘤中心表达强于在肿瘤周边的表达(P<0.01),而LRP蛋白在肿瘤中心的表达弱于在肿瘤周边的表达(P<0.01)。 结论:①Twist基因在转移能力强的MDA—MB—435S细胞中表达高于转移能力中等的MCF—7细胞,同时高转移的MDA—MB—435S细胞对紫杉醇的敏感性弱于中等转移性的MCF—7细胞,且更易出现耐药,提示:在人乳腺癌细胞株,twist基因表达情况与肿瘤细胞转移能力呈正相关性,与肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性成负相关,肿瘤细胞的转移性能可能与其药物耐药性具有一致性;②Twist蛋白在肾癌组织的边界区表达高于癌组织中心区,提示:Twist蛋白的表达可能与肾癌细胞的侵袭能力具有相关性;③在肾癌组织中Twist蛋白的表达部位和表达量与耐药蛋白P—gp、LRP的表达具有同步性,提示twist基因的表达与肾癌组织的耐药性相关;④Twist基因的表达与肿瘤转移、浸润以及耐药性存在相关性。
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