研究背景:A型流感病毒对宿主的特异性是由病毒表面糖蛋白血凝素(HA)介导,其结合的受体为末端含有唾液酸的糖链。禽流感病毒(AIV)主要与禽肠胃道上皮细胞表面的唾液酸(SA)α2-3半乳糖(Gal)的糖链受体结合,而人流感病毒与肺及呼吸道上皮细胞表面的SAα2-6 Gal的糖链受体特异结合。AIV抗原类型众多,变异频繁,导致高致病性禽流感(HPAI)防控非常困难。目前常规检测AIV手段并不能完全监测和评估宿主的特异性,因此有必要发展可用于监测和评估禽流感病毒病原的变异和宿主特异性的新技术。已有文献报道,糖芯片已应用于对H1和H3病毒宿主特异性的研究。本研究拟开发的糖芯片能根据病毒识别的糖链来快速确定禽流感病毒的宿主范围,判断出是否直接感染人类,可为HPAI的防控提供理论依据,为AIV的防治研究提供新的思路。目的:HA是禽流感病毒亚型内新变种判断的主要依据,本实验拟以对我国危害较为严重的H5、H9亚型禽流感病毒HA为研究对象,开发出可用于监测和评估禽流感病毒病原变异和宿主特异性的糖芯片,能对病料中感染因子或实验室感染病毒样品进行快速排查;筛查能与HA特异结合的糖链。方法:第一,克隆H5、H9亚型的HA基因,并利用杆状病毒表达系统表达HA蛋白;第二,分别通过羟基修饰玻片和肼基修饰玻片来制备两种糖芯片,并对这两种芯片的性能进行了比较研究;第三,将糖芯片技术用于对表达的HA蛋白宿主特异性的研究。结果:第一部分:本实验通过对H5、H9亚型的HA基因的扩增,得到大约1700 bp左右的片段,并且利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,成功构建了重组供体质粒H5HA-pFastBacHTa、H9HA-pFastBacHTa,测序正确后将这些供体质粒转化进含有杆粒和辅助细胞的E.coli DH10Bac中,发生转座作用形成重组杆粒H5HA-Bacmid、H9HA-Bacmid。重组杆粒转染sf9细胞后,形成重组杆状病毒rBac-H5HA、rBac-H9HA,并且在sf9细胞内成功地表达了H5HA和H9HA重组蛋白,分子量约为63 Kda。通过Westernt blotting和间接免疫荧光试验表明,所表达的H5HA和H9HA重组蛋白与天然的HA蛋白相似,均能为禽流感免疫血清所识别,具有良好的生物学活性。第二部分:对羟基修饰玻片和肼基修饰玻片这两种芯片制备方法进行了比较研究,得出以下结果:1.在羟基化修饰的玻片上,甘露糖(Man)最小检测浓度为1 nmol/L,而葡萄糖(Glu)最屑觳馀ǘ任?0μmol/L:在肼基修饰的玻片上,甘露糖最小检测浓度为5μmol/L,而葡萄糖最小检测浓度为100 nmol/L。2.当固定在玻片上甘露糖的浓度为1 mmol/L时,在羟基修饰的玻片上刀豆蛋白A(ConA)的检测限(可以检测到ConA的最低浓度)为0.25 nmol/L;在肼基修饰的玻片ConA的检测限为2.5 nmol/L。3.本实验制备的糖芯片特异性实验结果显示,ConA可以与Man、Glu、GlcNAc(N-乙酰葡萄糖胺)特异性结合:鸡冠刺桐凝集素(ECA)则与乳糖(Lac)、Gal特异性结合;四角莲凝集素(LT)可以与岩藻糖(Fuc)特异性结合。通过对羟基修饰的玻片和肼基修饰的玻片的比较,结果显示羟基修饰的玻片检测限更低,因此,我们选择羟基修饰的玻片制备糖芯片用于下一步的技术研究。总之,本实验比较了两种不同制备糖芯片的技术,确定了检测限低、结合稳定的羟基修饰玻片方法来制备功能糖芯片;并且成功在sf9体内表达了具有良好生物学活性的H5、H9亚型的HA蛋白;由于时间原因,还没有将表达的HA蛋白应用到糖芯片上,目前我们正在制备含有40种糖链的糖芯片,将用于表达出的HA蛋白特异性的研究。