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研究背景与目的DNA修复酶类是一类在维持细胞基因组稳定以及生物遗传稳定中发挥着重要的作用的酶。一些学者对食管癌遗传学进行研究发现,食管癌患者外周血细胞对DNA损伤后的修复能力明显的下降,同时DNA脆性增加,癌组织的细胞中有很多染色体明显改变,推测在食管癌的发生发展过程中一定伴有DNA的损伤修复。人DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)是人体修复酶之一,主要参与碱基切除修复(base exicision repair,BER)以及跨损伤修复,对受损或突变基因起修复作用。各种内源性或外源性的有害因素造成的polβ基因结构或表达的改变,都有可能最终促使肿瘤的发生和发展。有研究发现,在食管癌组织中存在着polβ基因mRNA的高表达和polβ基因突变,并且发生于癌变早期。提示polβ基因突变和过表达可能与食管癌的发生发展有关。基因转录受启动子、增强子及应答元件等顺式作用元件的控制;也受转录调节因子、基本转录因子、上游转录因子等反式作用因子的调节。因此,基因转录活性的改变不仅可能由于启动子碱基的异常或突变而引起,而且可能由于不同种类细胞内环境中存在的反式作用因子类型不同与启动子等顺式作用元件结合而导致转录活性上调或下调。先前本课题组研究发现人食管癌组织polβ基因启动子碱基序列存在不同形式突变且许多突变位点可引起其启动子转录活性的改变。基此,本实验拟探讨人食管癌细胞株EC-1和正常永生化细胞293T细胞中DNA polβ启动子核心区基因突变情况及构建含人野生型和突变型polβ基因启动子的荧光素酶表达载体,比较野生型DNA polβ启动子报告基因载体、突变型DNA polβ启动子报告基因载体在肿瘤细胞(EC-1和Eca9706细胞)和正常永生化细胞中启动子活性强弱,以此探讨食管癌细胞株EC-1中DNA polβ启动子的突变形式对其启动子转录活性的影响,以证实肿瘤细胞中是否具有促进DNA polβ启动子活性增加的作用因素。材料与方法1.提取食管癌细胞株EC-1和永生化细胞293T细胞基因组DNA:按照AXYGEN质粒小量提取试剂盒的操作规程提取2种细胞基因组DNA。2.扩增食管癌细胞株EC-1和293T细胞DNA polβ基因启动子片段并确定突变位点:设计扩增polβ基因启动子引物,PCR扩增食管癌细胞株EC-1和293T细胞polβ基因核心启动子片段,与pGEM-T Easy质粒连接,然后转化感受态细菌DH-5α,通过α互补实验以及采用通用引物T7/SP6行PCR以鉴定重组子pGEM-T-polβ/promoter是否转入。正反双向测序后,采用DNASIS、OMIGA软件将测序结果与GenBank查到DNA polβ启动子序列进行同源性比较,分析确定食管癌细胞株EC-1和293T细胞是野生型或突变型polβ启动子并确定突变位点。3.构建含食管癌细胞株EC-1和永生化细胞293T细胞polβ基因启动子的荧光素酶报告基因载体并鉴定:将已提取并测序正确的重组T载体(pGEM-T-polβ/promoter)和荧光素酶报告基因载体pGL3-neo-enhancer,用XhoⅠ和HindⅢ分别做双酶切,回收纯化的双粘polβ启动子目的片段,亚克隆至双粘线性PGL3-neo-enhancer荧光素酶报告基因载体,得到重组质粒pGL3-neo-polβ/promoter。质粒pGL3-neo-polβ/promoter经XhoⅠ和HindⅢ双酶切和PCR鉴定后,正反双向测序以鉴定构建的含食管癌细胞株EC-1和永生化293T细胞polβ基因启动子的荧光素酶报告基因表达载体的正确性,并确认突变存在位点仍然正确。即构建成分别含永生化293T细胞和食管癌细胞株EC-1 polβ基因启动子的荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-neo-293T-polβ/promoter和pGL3-neo-EC-1-polβ/promoter)。4.质粒转染:转染前细胞分为4组:(1)空白组:未转染任何质粒的食管癌细胞株Eca9706、食管癌细胞株EC-1及293T细胞;(2)对照组:转染PGL3-neo-enhancer空载体;(3)野生组:转染含239T细胞polβ基因启动子序列的荧光素酶报告基因载体pGL3-neo-293T-polβ/promoter;(4)突变组:转染含食管癌细胞株EC-1-137位和-166位点G→A突变的polβ启动子序列荧光素酶报告基因载体pGL3-neo- EC-1-polβ/promoter。用脂质体Lipofectamine 2000分别将(2)、(3)和(4)组转染食管癌细胞株EC-1,Eca9706细胞及293T细胞,G418筛选阳性细胞克隆。每组至少重复实验3次。5.检测荧光素酶活性:使用荧光素酶萤光检测仪作各组荧光素酶活性测定,取各组所测得数值的平均值。6.统计学处理:荧光素酶活性检测数据分析处理用(?)±s表示,用SPSS 14.0统计软件行单因素方差分析,以P＜0.05为差异有显著性。结果1.PCR扩增食管癌细胞株EC-1和293T细胞polβ启动子片段和突变位点的确定:以提取的食管癌细胞株EC-1及293T细胞基因组DNA为模板,经PCR扩增获得polβ基因启动子序列,电泳可见食管癌细胞株EC-1和293T细胞在499bp处有一条带,与该片段的理论值一致,正反双向测序PCR扩增产物并进行同源性比较和分析,确定293T细胞polβ基因启动子序列与GenBank一致的正常序列为野生型,食管癌细胞株EC-1包含-137位和-166位G→A位点的突变为突变型。2.含食管癌细胞株EC-1和293T细胞polβ基因启动子的荧光素酶报告基因重组质粒的构建和鉴定:将食管癌细胞株EC-1及293T细胞的polβ基因启动子序列插入荧光素酶报告载体的多克隆位点行PCR扩增及XhoⅠ和HindⅢ双酶切筛选阳性克隆,其产物均在392bp处可见电泳条带,与该片段的理论值一致。DNA正反双向测序鉴定插入的野生型序列正常,突变型的突变位点正确不变,表明pGL3-neo-EC-1-polβ/promoter和pGL3-neo-293T-polβ/promoter载体构建成功。3.荧光素酶活性分析:三种不同质粒pGL3-neo(对照组)、pGL3-neo-293T-polβ/promoter(野生型)和pGL3-neo-EC-1-polβ/promoter(突变型)分别转染入食管癌细胞株EC-1或分别转染入食管癌细胞株Eca9706细胞或分别转染入293T细胞后,每种细胞的野生组和突变组分别与对照组(pGL3-neo)比较,差异均有显著性,P＜0.001,野生组和突变组之间比较,差异均有统计学意义,P＜0.001。pGL3-neo(对照组)质粒或pGL3-neo-293T-polβ/promoter重组质粒(野生型)各自分别转染入三种不同细胞后各细胞间荧光素酶活性值比较,差异均无统计学意义,P＞0.001;而pGL3-neo-EC-1-polβ/promoter(突变型组)分别转染入三种不同细胞后,转染入EC-1与Eca9706细胞荧光素酶活性测定值比较无显著性差异,但转染入EC-1、Eca9706分别与293T比较,差异均具有高度显著性,P＜0.001。结论1.证实食管癌细胞株EC-1DNA polβ基因启动子存在-137位和-166位G→A位点的突变;293T细胞DNA polβ基因启动子为野生型。2.成功构建含食管癌细胞株EC-1突变型DNA polβ基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-neo- EC-1-polβ/promoter和含正常永生化细胞293T野生型polβ基因启动子的荧光素酶报告基因载体pGL3-neo-293T-polβ/promoter。3.食管癌细胞株EC-1DNA polβ基因启动子突变位点可使其启动子活性增强。4.野生型、突变型DNA polβ启动子报告基因载体在EC-1、Eca9706肿瘤细胞中启动子活性显著高于正常永生化细胞293T。提示肿瘤细胞中具有促进DNA polβ启动子活性增加的作用因子。本实验为进一步研究食管癌中polβ基因启动子奠定了基础并为肿瘤靶向基因治疗提供新思路。