胎盘滋养细胞无论在人类妊娠早期胚泡的植入还是在妊娠晚期对胎儿生长发育的调节过程中，都发挥着重要的作用。在正常妊娠的早、中、晚各期均有胎盘滋养细胞的增殖和凋亡，细胞增殖与凋亡的协调和平衡是机体维持正常发育及保持稳态的重要保障。胎盘滋养细胞的增殖和凋亡在胎盘的发育、成熟和老化的过程中起重要作用，孕早期滋养细胞的增殖能力异常可能会导致流产、葡萄胎等病理妊娠;而孕晚期滋养细胞增殖能力异常可能会导致子痫前期和胎儿宫内生长受限(FGR)等病理妊娠，影响胎儿的生长发育和母婴健康。　　 miRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，它通过与其目标mRNA分子的3端非编码区域(3-untranslatedregion，3UTR)互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到抑制。最近研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50％的miRNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点，这说明miRNAs在肿瘤发生过程中期至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNA命名为“oncomirs”。例如:充当抑癌基作用的miR-125b-1，位于染色体的11q24脆性位点，乳腺癌、肺癌、卵巢癌病人中此位点缺失，而这一位点并不存在已知的抑癌基因。MiR-21在胶质母细胞瘤中表达增加[12]，这个基因在肿瘤组织中表达量比正常组织高5-100倍，反义核酸的研究发现这个miRNA通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA具有癌基因的功能。　　 而胎盘滋养细胞的增殖行为无疑与恶性肿瘤有诸多的相似之处，我们有理由相信滋养细胞的增殖行为可能受到某些miRNA的调控。近年来关于人类绒毛滋养细胞表达与分泌胎盘特异性miRNA的研究刚刚起步，2009年证实miR-512-3p、miR-517a、miR-517b、miR-518b、miR-519a、miR-1185、miR-1283以及miR-1323仅在胎盘中表达[13]，被称为胎盘特异性miRNA(placenta-specific microRNA，PS miRNA)。　　 本文通过在体研究人类胎盘绒毛（包括不同增殖能力人工流产绒毛、胎儿生长受限胎盘、巨大儿胎盘等），证实某些PS miRNA对滋养细胞增殖功能具有调控作用，并筛查有调控作用的miRNA的靶蛋白，确定其通过靶蛋白行使调控滋养细胞增殖能力的机制。通过沉默miRNA上游调节因子Dicer基因的表达，研究其对下游miRNA功能的调控作用，为调控滋养细胞增殖寻找出一条可能的通路。　　 方法：　　 第一部分:应用荧光实时定量RT-PCR法，绝对定量8种PS miRNA在不同增殖能力胎盘组织中的表达量差异:　　 1、早孕绒毛:以妊娠周数作为匹配条件，留取正常妊娠人工流产妇女的胎盘绒毛。分别于妊娠第6周、7周、8周、9周，取重量最大的胎盘绒毛10例（H组）与重量最小的胎盘绒毛10例（L组）。相同孕周的两组绒毛的重量有统计学差异。　　 2、足月妊娠胎盘:以胎儿出生体重为分组标准，体重小于25009为低出生体重组(SGA)，大于40009为高出生体重组(LGA)，选取无妊娠期并发症和合并症的近足月剖宫产妇女的胎盘组织分为LGA组、SGA组和正常出生体重组(N)各30例。　　 应用荧光原位杂交法，观察差异表达的PS miRNA在胎盘绒毛中的表达部位。找到表达量及表达部位均有意义的PS miRNA。　　 第二部分:生物信息学软件预测差异表达的胎盘特异性microRNA的潜在的靶基因。通过荧光素酶活性分析及western blot进一步验证此差异表达的胎盘特异性microRNA的靶蛋白。体外培养HTR-8/Svneo滋养细胞，脂质体2000介导转染差异表达的PS miRNA的模拟物(mimics)和阻遏物(inhibitor)进入HTR-8/Svneo细胞。MTT比色法检测转染前后HTR-8/Svneo细胞的增殖能力的变化，Transwell法检测转染前后HTR-8/Svneo细胞侵袭能力的变化，流式细胞术检测转染前后HTR-8/Svneo细胞凋亡能力的变化。　　 第三部分:体外培养HTR-8/Svneo滋养细胞中，siRNA干扰的方法沉默miRNA的上游调节因子Dicer基因，实时定量PCR和western方法检测siRNA干扰后Dicer mRNA和蛋白的表达。Taqman实时定量PCR法检测Dicer基因沉默后PS miRNA-519a的表达量的变化，MTT法检测Dicer基因沉默后对HTR-8/Svneo细胞增殖能力的影响。　　 结果：　　 第一部分:我们利用Taqman实时定量RT-PCR方法检测8种PS miRNA在具有不同增殖能力的胎盘绒毛中的表达量。发现PS miR-519a在倾向于增殖能力较强的“绒毛重量较大组”中表达增高，而在倾向于增殖能力较弱的“绒毛重量较小组”中表达降低;在“出生体重小于胎龄儿组”表达增高，“出生体重大于胎龄儿组”表达明显减少。进一步的荧光原位杂交观察PS miR-519a在胎盘绒毛组织中的表达部位发现，PS miR-519a几乎只在绒毛末端的“滋养细胞层”中阳性表达，“绒毛间质”中无表达。　　 第二部分:通过生物信息学软件预测PS miR-519a的潜在的靶基因。发现多种与细胞侵袭、增殖、凋亡密切相关的基因。其中一种可能的靶基因——PTEN引起我们的注意:有大量文献报道PTEN与滋养细胞的形成密切相关，而且PTEN可以通过依赖PI3K和不依赖PI3K的途径调节细胞的生长和增殖。PTEN不仅是一种抑癌基因，有研究报道PTEN通过影响细胞的体积和增殖而与骨巨细胞瘤、卵巢中的卵母细胞、霍奇金淋巴瘤中的R-S细胞等大细胞的形成有关。胎盘滋养细胞是人体的一种特殊的大细胞，有文献报道PTEN在滋养细胞的表达明显强于其周围体积较小的间质细胞，表明PTEN可能与细胞大小及滋养细胞的功能有关。PTEN对妊娠滋养细胞生物学功能的影响方向均与我前面实验中PS miR-519a对滋养细胞生物学功能的影响方向相反。因此我们初步选定PTEN进行下一步的靶基因鉴定实验。随后的荧光素酶活性分析实验发现共转染PTEN3UTR荧光素酶载体和PS miR-519a表达载体组的报告基因活性相对于对照组显著降低，在PS miR-519a的作用下，PTEN3UTR荧光素酶载体的荧光活性下调大于70％。由此证明，PTEN3UTR区可被PS miR-519a特异性识别并与之结合。进一步的Western blot实验发现与对照组相比，实验组的PTEN蛋白表达水平显著降低＞40％。表明PS miR-519a可能在翻译水平抑制PTEN的表达，PTEN是PS miR-519a的靶蛋白。　　 瞬时转染PS miR-519a的转染效率达到70-80％，转染入PS miR-519a-mimics的M组HTR-8/Svneo细胞中PS miR-519a表达明显上调，是对照组的10.10±0.37倍(P＜0.001)，转染入PS miR-519a-inhibitor的Ⅰ组HTR-8/Svneo细胞中PS miR-519a的表达水平明显下调，是对照组的0.12±0.41倍（P＜0.001），转染入PS miR-519a-mimicsnegative及miR-519a-inhibitor negative的Mn组、Inc组HTR-8/Svneo细胞与对照组HTR-8/Svneo细胞之间的PS miR-519a表达无明显统计学差异。表明PSmiR-519a-mimics明显增加了HTR-8/Svneo细胞中PS miR-519a的表达，而PSmiR-519a-inhibitor则明显抑制了PS miR-519a的表达。转染了PS miR-519a-mimics的M组细胞增殖能力变强，在转染后24小时、48小时和72小时，活细胞计数较转染了PSmiR-519a-inhibitor的Ⅰ组明显增多、吸光度明显增高(P＜0.01)。提示PS miR-519a可以促进HTR/svneo细胞的增殖。流式细胞仪检测发现转染了PS miR-519a-mimics的M组细胞中的凋亡细胞明显减少(P＜0.01)，而PS miR-519a-inhibitor则明显促进了HTR-8/Svneo细胞的凋亡。提示PS miR-519a可以抑制HTR-8/Svneo细胞的凋亡。细胞在转染PS miR-519a-mimics后的transwell实验中侵袭能力明显变强，M组HTR-8/Svneo细胞穿出transewell小室的细胞数量明显高于Ⅰ组(P＜0.01)。提示PS miR-519a可以促进HTR-8/Svneo细胞的侵袭能力。　　 第三部分:细胞免疫组化显示HTR-8/Svneo细胞中广泛表达Dicer蛋白，棕黄色颗粒广泛沉积在细胞质和胞浆中。利用脂质体介导的siRNA细胞转染的方法沉默Dicer基因，实时定量PCR结果显示:siDicer-HTR-8/Svneo基因的mRNA水平表达下降（79.67±2.56）％，p＜0.001，差异具有统计学意义。SiNC-HTR-8/Svneo转染组细胞Dicer基因的mRNA是未转染组细胞表达水平的（106±7.38）％，p＞0.05，差异无统计学意义。表明siRNA-Dicer能有效抑制Dicer mRNA表达。同时在蛋白水平:westenblot检测siDicer-HTR-8/Svneo细胞Dicer基因的蛋白水平下降超过40％，p＜0.001，差异具有统计学意义。而SiNC-HTR-8/Svneo转染组细胞Dicer基因的蛋白水平是未转染组细胞表达水平的（103.25±4.37）％，p＞0.05，差异无统计学意义。表明siRNA-Dicer能有效抑制Dicer蛋白的表达。Taqman荧光实时定量RT-PCR结果显示:与未转染组相比siDicer-HTR-8/Svneo细胞PS miR-519a表达水平显著降低＞40％，表明沉默Dicer基因后可抑制HTR-8/Svneo细胞中PS miR-519a表达。MTT法来检测转染DicersiRNA的HTR-8/Svneo细胞的增殖能力:在转染后72h,siDicer转染的HTR-8/Svneo细胞增殖能力增强，与对照组相比较，差异具有统计学意义。表明降低Dicer表达，能促进胎盘滋养细胞的增殖能力。　　 结论：　　 Dicer在胎盘绒毛滋养细胞层，通过改变自身表达量，影响胎盘特异性PS miR-519a的合成，从而在蛋白质水平对PTEN基因的表达进行调控，改变胎盘滋养细胞的增殖、凋亡功能。