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目的Hlx在胚胎发育、胃肠功能及脊髓神经生长等方面发挥着重要的作用,同时也是参与CD4阳性T细胞分化调节的重要转录因子。鉴于Hlx对相关组织细胞生长发育和免疫细胞调节的双重作用,本研究在考察Hlx对树突状细胞免疫功能调节作用的基础上,分析其在脑脊髓损伤介导的炎症应答中的作用和免疫应答类型,了解其对消化系肿瘤患者免疫状态的影响。(1)为了体外探讨转录因子Hlx在树突状细胞中的作用,构建携有小鼠Hlx基因的真核表达质粒,转染鼠树突状细胞系,建立稳定高表达Hlx的小鼠DC2.4细胞株,研究其生物学行为和功能的改变,并作为一种工具,为进一步研究Hlx对树突状细胞免疫功能的影响和在免疫应答调节中的作用奠定基础。(2)建立脑脊髓损伤动物模型,并在建立大鼠脑脊髓损伤动物模型的基础上,通过分析脑脊髓损伤大鼠的Thl和Th2两类细胞因子的基因表达与转录因子T-bet和GATA3表达的相关性,从细胞因子与转录因子的角度考证脑脊髓损伤的大鼠Th1/Th2细胞分化趋势和大鼠脑脊髓炎症与T-bet和IFN-γ的相关性,了解T-bet、IFN-γ与脑脊髓损伤与炎症发生发展之间的关系。介于Hlx对胚胎发育和免疫应答调节的双重作用,对Hlx在脑脊髓损伤时Thl/Th2细胞平衡状态的影响进行分析。(3)应用荧光定量PCR方法检测消化系肿瘤(胃癌)患者外周血单个核细胞中Hlx mRNA表达水平的改变,分析Hlx对患者机体Thl/Th2平衡状态的影响,探讨Hlx在疾病发生发展中的作用。方法(1)构建pIRES2-mHlx-EGFP:采用PCR方法,以含Hlx基因的PGEM-T质粒为模板扩增Hlx基因,将其克隆至pIRES2-EGFP真核载体,进而通过PCR,双酶切筛选阳性克隆并进行序列测定。(2)筛选获得高表达Hlx的DC2.4细胞系：用脂质体将pIRES2-mHlx-EGFP转入DC2.4细胞,经600μug/ml G418筛选和根据EGFP标记进行克隆、亚克隆,获得稳定表达EGFP的抗性DC2.4细胞株,再经RT-PCR、Western-blot筛选出稳定高表达Hlx的细胞克隆。(3)应用real-time PCR检测DC2.4/Hlx细胞或胃癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)H1x T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4、IL-12p40、IL-12p35、IL-6等因子的表达变化；胃癌患者测得的Hlx与健康对照组进行比较研究,与此同时分析胃癌患者Hlx表达的水平与T-bet表达的关系,着眼转录因子水平探讨患者机体Th1/Th2细胞平衡失调的可能机制。(4)ELISA方法检测细胞培养上清和外周血中IFN-γ、IL-12P70、 TNF-α、IL-10等相关细胞因子的表达水平。(5)流式细胞仪分析细胞表面分子的改变：应用PE标记的MHCI、MHCII、CD40、CD80、CD86、TLR4、CCR7单克隆抗体对不同细胞株进行染色,再应用流式细胞仪分析表面分子的变化。(6)树突状细胞吞噬功能分析：高表达Hlx的DC2.4细胞系与表达红色荧光蛋白HcRed的大肠埃希菌(经3%多聚甲醛固定)共育于37℃2h,FACS分析吞噬大肠埃希菌的树突状细胞数,以此反映高表达H1x的DC2.4细胞吞噬功能状态(设定LPS刺激组为阳性对照)。(7)树突状细胞抗原提呈作用：100mg/L OVA刺激树突状细胞(包括高表达Hlx的DC2.4)24h,然后于37℃下用30mg/L的mitomycin C处理20分钟,冷PBS洗两次备用。无菌分离OVA免疫的C57BL/6小鼠脾脏,MACS分离CD4+的T细胞,3mmol/L CFSE染色后备用。于24孔板中接种2×106个CFSE标记的CD4+T细胞和2×105个树突状细胞,共培养3天,流式细胞仪分析。(8)MTT法检测细胞增殖：于96孔板每孔接种2×105CD4+T细胞和2×104个树突状细胞共培养,三天后MTT法检测细胞增殖状态。(9)脑、脊髓损伤大鼠模型的制备：采用物理损伤和LPS损伤模型,即用0.3%戊巴比妥钠(10ml/kg)腹腔麻醉后,经T12椎体棘突行背正中切口,钝性分离皮肤和肌肉,把胸十一到腰一的棘突及椎板暴露出来,然后用止血钳去掉胸十二的棘突及椎板,使脊髓两侧和背侧充分暴露,切断脊髓,大鼠双下肢对称性抽搐,随后出现瘫痪,缝合肌层及皮肤复制脊髓横断损伤模型。LPS损伤模型则是在充分暴露脊髓背侧和两侧后于蛛网膜下腔注射LPS。结果(1)建立了稳定高表达mHlx的DC2.4细胞株(DC2.4/mHlx)：PIRES2-mHlx-EGFP和PIRES2-EGFP分别转染树突状细胞系DC2.4,经G418抗性筛选得到抗性细胞株,再经FACS、RT-PCR、Western-blot鉴定,并经克隆化获得高表达mHlx的DC2.4/mHlx细胞株。(2)高表达Hlx的DC2.4显示促Th1细胞分化的潜能和抗原提呈功能的改善：RT-PCR结果表明,过表达Hlx的DC2.4/Hlx,其T-bet、 Hlx、IFN-γ、IL-12p35、IL-12p40、IL-6的mRNA水平均增加,而转录因子GATA3无明显改变,IL-4表达阴性；ELISA结果表明,细胞培养上清中细胞因子IFN-γ和I1-12p70分泌增加。反映抗原提呈功能的表面分子分析结果显示,MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CD40等表达均增加,吞噬能力明显下降,体外特异性抗原提呈能力明显增强。(3)在LPS刺激脑脊髓损伤的模型中,大鼠的脑组织和脊髓组织中T-bet与IFN-γ的表达水平明显高于正常对照组,GATA3、IL-4的表达却没有明显改变。此外,ELISA检测损伤的脑脊髓组织匀浆中TNF-α和IL-10细胞因子水平表明,TNF-α在损伤的开始即明显升高；而IL-10则在损伤早期呈低表达,而中后期则呈升高趋势。这表明在脑脊髓损伤早期可能表现为Th1细胞分化优势,这与IFN-γ表达上调的结果相一致。(4)对脑、脊髓损伤模型Hlx的分析结果显示,在LPS刺激脑、脊髓损伤的模型中,大鼠的脑组织和脊髓组织中,H1x的表达水平显著升高并同时伴有T-bet和IFN-γ的高表达,而GATA3、IL-4的表达却没有明显改变。通过相关性分析表明,脊髓损伤后脊髓中Hlx的表达水平与T-bet、IFN-γ的表达存在高度相关性；且基于Hlx和T-bet调控的IFN-γ表达水平与大鼠脑、脊髓损伤的程度也存在着密切的关系,表明IFN-γ作为Th1细胞特异性细胞因子,在脊髓损伤过程中发挥重要作用；同时也提示在脊髓损伤时可能有T细胞的浸入,并在Hlx和T-bet的共同作用下维持着Th1细胞优势状态和高IFN-γ表达水平,对脊髓二次免疫炎症性损伤起着促进的作用。然而在脊髓横断损伤的脑组织中,尽管IFN-γ的表达升高,但转录因子H1x、T-bet和GATA3的表达都没有明显改变,推测Th1细胞及其它来源的IFN-γ等细胞因子可释入受损脑组织,而存在于Th1或Th2细胞内的核转录因子T-bet、H1x或GATA3,则可因T细胞未能及时浸入脑组织或浸润脑组织较少而呈低水平表达。(5)实时荧光定量PCR测定胃癌病人PBMC中Hlx的表达水平：结果可见,Hlx的mRNA表达水平明显低于健康对照组,且与T-bet表达水平呈明显正相关。提示胃癌患者存在着Hlx和T-bet表达同步下降的趋势,可能是肿瘤患者机体杀瘤特异性Th1细胞功能或比率降低的重要因素。推测,基于Hlx表达低下的Th2细胞优势分化趋势,及其所导致的Th1/Th2细胞平衡失调,也许构成消化系肿瘤患者机体免疫微环境的基本状态。结论在未成熟树突状细胞系DC2.4中,过表达转录因子HIx,可以促进IFN-γ的转录和表达,进而促使树突状细胞成熟、IL-12分泌增加、吞噬能力下降、抗原提呈能力增强。能够更有效的促进同基因型来源的CD4+T细胞的分裂增殖。Hlx表达水平与脑脊髓损伤介导的免疫炎症有关,其可促进损伤机体Th1细胞优势分化状态,对脊髓二次免疫炎症性损伤起着推波助澜的作用。在损伤的脊髓和脑组织中存在着细胞因子IFN-γ和Th1细胞特征性转录因子T-bet、Hlx的分布差异,可能因为脊髓损伤时发生了T细胞的浸入,使其特征性转录因子在脊髓的表达增加；而T细胞因未能及时浸入脑组织或浸润脑组织较少,使转录因子T-bet、Hlx在脑组织中的表达水平没有明显改变,但Th1细胞特征性细胞因子IFN-γ仍在损伤脑组织表现为上调。由于Hlx对胃肠组织发育起重要作用,因此我们检测了Hlx在胃癌患者中表达水平的变化。发现胃癌表现的Th2细胞极化状态与Hlx表达水平的降低有关,Hlx表达的低下有碍Th1介导的抗瘤免疫应答。