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本文以贻贝为原料,利用酶解技术、超滤法、凝胶层析技术、离子交换层析技术和反相高效液相色谱技术等多种分离纯化手段,研究了贻贝蛋白的酶解工艺,抗肿瘤生物活性肽的制备工艺及活性肽的体外抗前列腺癌的活性功能及分子机制。在酶解工艺优化研究中,采用正交实验方法,主要研究了料液比、PH值、酶解温度、酶解时间和加酶量对贻贝的酶解效果和酶解物抗肿瘤活性的影响,实验结果如下:实验选用了碱性蛋白酶(Alcalase)、胰蛋白酶(Trypsin)和胃蛋白酶(Pepsin)共3种蛋白酶,当以酶解物的水解度为评价指标时,所得到的各蛋白酶的最佳水解条件为:Alcalase:料液比为1:4、pH值为10、加酶量为2000U/g、温度为50℃、水解时间为8h;Trypsin:料液比为1:4、pH值为8.5、加酶量为1000U/g、温度为45℃、水解时间为8h;Pepsin:料液比为1:5、pH值为5、加酶量为1500U/g、温度为45℃、水解时间为8h;而当以酶解物的抗肿瘤活性为评价指标所得到的各蛋白酶的最佳水解条件为:Alcalase:料液比为1:4、pH值为10、加酶量为1500U/g、温度为50℃、水解时间为8h;Trypsin:料液比为1:4、pH值为8、加酶量为1500U/g、温度为40℃、水解时间为2h;Pepsin:料液比为1:4、pH值为5、加酶量为1500U/g、温度为55℃、水解时间为8h。当以3种蛋白酶抗肿瘤活性指标得到的最佳水解条件对贻贝蛋白进行水解,所得到的水解物中以Trypsin水解物的水解度最高,而以Alcalase水解物的抗肿瘤活性最强。在活性肽制备工艺中,首先选用的是超滤法,通过用截取分子量为10KDa、5KDa和3KDa的超滤膜进行超滤后,共得到4个组分即MH1(>10KDa)、MH2(5-10KDa)、MH3(3-5KDa)和MH4(<3KDa),其中以分子量最小的MH4抗肿瘤活性最强,在浓度为0.5mg/mL、作用48h后,对DU-145和PC-3细胞的增殖抑制率分别为33.17%和30.24%。将MH4经DEAE-SepharoseFF离子交换层析后,又得到了4个组分,即MH4-1、MH4-2、MH4-3和MH4-4,这4个组分均具有抗肿瘤活性,但以MH4-2活性最强,将其经SephadexG-25凝胶层析后,得到了3个组分,即MH4-2-1、MH4-2-2和MH4-2-3,以MH4-2-1抗肿瘤活性最强。将该组分经反相高效液相柱Zorbax SB C18纯化后,最终得到了纯度较高的活性肽APMH,该肽分子量为391.2 Da,对DU-145和PC-3细胞均有很好的增殖抑制活性,并且呈现浓度和时间依赖性,同时对DU-145细胞的抑制活性优于PC-3。HE染色结果表明,APMH作用后,DU-145和PC-3细胞中均出现细胞空泡和胞核浓缩等典型的细胞凋亡特征;Annexin V-FITC/PI流式细胞术双染色分析结果显示,APMH作用24h后,DU-145和PC-3细胞均出现凋亡情况,并且随着浓度的增加,细胞凋亡率和细胞坏死率均增加;免疫组化结果表明,APMH对DU-145和PC-3作用48h后,凋亡负调控因子Bcl-2的表达量急剧下降,而凋亡诱导途径中的重要蛋白酶Caspase-3和Caspase-9的表达量大量增加。据此可知,APMH抗肿瘤的作用机制之一是诱导细胞凋亡,而诱导凋亡的分子机制是下调Bcl-2及上调Caspase-3和Caspase-9的表达。