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MON88017是Monsanto公司通过农杆菌介导转化方法,将含有cry3Bb1和cp4 epsps两个基因表达盒的质粒载体PV-ZMIR39导入玉米Hi-II细胞中得到的转基因玉米品系。对MON88017的分子生物学分析证实,只有单一拷贝的cp4 epsps和cry3Bb1基因表达盒整合到MON 88017的基因组中的单一位点上;各种表达元素完好无损;没有任何细菌质粒骨架序列插入MON88017基因组。本实验采用基因组步移法和巢式PCR方法测定出MON88017外源DNA导入位点旁侧序列,并根据旁侧序列设计转化体特异性(event specific)PCR检测引物,进行定性PCR扩增,确定了引物的最佳反应条件,从而建立起该转基因玉米品系的转化体特异性检测方法。在定性PCR基础上,设计合适的引物和探针,利用定量PCR扩增仪进行荧光实时定量PCR扩增,通过与标准曲线比对,确定产品中转基因成分含量,从而建立起一套完整的抗虫抗除草剂玉米MON88017及其产品转基因成分定量检测体系。详细结果如下:(1)采用基因组步移法和巢式PCR方法获得转基因玉米MON88017外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp。序列同源性分析表明,从5’端开始前168bp为玉米基因组序列,从第169bp至3’末端为插入到玉米中的载体序列,其中从第169bp~479bp为间插序列,从第480bp至3’末端为水稻中启动子P-ract1部分序列。(2)根据转基因玉米MON88017左边界序列,采用Primer premier 5.0软件设计了3对MON 88017转化体特异性引物,对3对特异性引物进行筛选和反应条件优化,确定最适的特异性引物MON88017-1F/R(446bp),其最适退火温度为56℃。通过验证,该引物MON88017-1F/R具有较高的特异性和准确性。用特异性引物MON88017-1F/R对不同浓度的DNA进行检测表明,在MON88017 DNA稀释至0.1%时,仍能扩增出446 bp的特异性目的片段,说明该转基因玉米的最低检测极限(即灵敏度)较高,为0.1%。该定性PCR方法完全可以满足转基因玉米品系的转化体特异性检测的要求。(3)根据转基因玉米MON88017左边界序列,采用Primer Express2.0软件设计了转化体特异性定量引物MON88017-F/R(87bp)和Taqman探针MON88017-P,通过筛选和反应条件优化,确定其最适退火温度为60℃。进行实时荧光定量PCR检测,Taqman探针法定量PCR检测结果显示,0.01%的转基因含量可检测出,灵敏度高于定性PCR检测方法,表明所设计的定量PCR引物、探针特异性好,所建立的实时荧光定量PCR检测体系准确、可靠、灵敏度高。