造血干细胞(hemopoietic stem cells,HSCs)是一类多能的、具有自我增殖分化能力的原始造血细胞,其生长及生理功能的发挥依赖于造血微环境。造血细胞及其微环境之间相互依存,共同决定着造血细胞的命运以及造血功能的状态。骨髓造血微环境主要包括造血组织中的基质细胞、细胞外基质和各种造血因子,其可以通过各种微环境信号调控造血干细胞的自我更新、定向分化以及动员、增殖、迁移等。巨核细胞(Megakaryocyte,Mk)是HSCs经过一系列的成熟分化过程产生的血小板前体细胞。除了生成并释放血小板,Mk还在生理和病理条件下参与骨髓龛(niche)的建立和维持,构成能确保造血干/祖细胞恰当地分化成所有血细胞系的微环境。Mk与骨髓环境中的其他细胞和细胞外成分相互作用,以维持造血功能以及外周血的稳态和生理机能。有意义的是,Mk涉及到细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的沉积和重塑;反过来,Mk的成熟分化也依赖于细胞外基质的参与。造血干细胞发育的活跃增生及Mk的成熟分化都与基质重塑密切相关。在研究Mk对造血调控的过程中,我们关注一个新基因,即MXRA7(matrix remodeling associated 7,暂译作基质重塑相关基因7)。该基因最初因总是与其他跟基质重塑相关的已知基因(如MMPs、TIMPs、BM40)等共同表达而被命名,提示MXRA7可能参与基质重塑,因此也便有可能参与Mk对造血的调控过程中。此外,病理状态也会影响造血功能,其中糖尿病对造血系统功能的影响是值得探讨的重要问题之一。糖尿病作为常见的代谢病,其首要靶器官是循环系统,其中糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)的过度积累是糖尿病的典型特征,也是引起糖尿病微血管并发症的主要病理因素。已知高血糖会破坏骨髓微环境,但目前关于糖尿病对造血干细胞和造血微环境的影响仍不清楚。因此,本课题就MXRA7和AGEs对巨核细胞发育和造血系统调控的作用进行研究。第一部分 基质重塑相关基因7对巨核细胞发育和造血系统的调控作用目的:从造血微环境中寻找、鉴定作用于造血干细胞的分子,对阐明造血机制具有重要意义,也将对相关的临床实践(如造血疾病治疗、造血干细胞移植、造血重建等)具有指导作用。基质重塑相关基因7(MXRA7)是一个功能知之甚少的新基因,公共数据库显示MXRA7在造血系统细胞中有阶段依赖性表达,说明其可能参与造血过程。因此我们对MXRA7在造血系统中的作用进行研究。方法:1、首先比较正常野生型小鼠(WT小鼠)和MXRA7基因敲除鼠(MXRA7-/-小鼠)的造血系统是否有差异:采集小鼠的外周血,利用血细胞计数仪检测外周血中红细胞、白细胞、血小板的数量;分离获得脾脏和骨髓的单细胞悬液并进行细胞计数;取骨组织固定制备石蜡切片,进行HE染色;骨髓涂片瑞氏染色用于巨核细胞分类计数;流式染色分析骨髓细胞中巨核细胞的差异。2、研究MXRA7对造血干祖细胞细胞分化的影响:利用集落形成细胞实验(colony-forming cell,CFC)和诱导分化实验鉴定MXRA7基因缺失对造血干祖细胞增殖、分化的影响。3、比较WT小鼠和MXRA7-/-小鼠血小板功能的差异:利用尾出血时间、血小板聚集实验、血块收缩实验、血小板寿命检测、流式细胞术分析血小板的活化和凋亡等实验比较两者血小板的差异。4、体外细胞实验研究MXRA7对巨核祖细胞MEG-01生物学功能的影响:构建sh-MXRA7慢病毒载体,通过慢病毒感染的方法将sh-MXRA7转入MEG-01细胞建立干扰MXRA7的稳定细胞系;CCK8检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡;TPO诱导分化,利用流式细胞术检测巨核细胞分化标记、多倍体和血小板样颗粒;利用定量PCR检测巨核细胞发育相关基因的表达;利用光学显微镜检测巨核细胞前血小板形成(proplatelet formation,PPF);荧光免疫染色检测巨核细胞β-Tubulin的重排;利用蛋白印迹技术检测ERK、AKT的磷酸化水平及促凋亡蛋白Bax的水平。5、在体内实验中,使用小鼠非清髓模型和骨髓细胞移植模型来研究MXRA7对造血细胞恢复和重建的作用:WT和MXRA7-/-小鼠经非清髓辐照后检测造血恢复情况;野生型小鼠经清髓辐照后移植WT和MXRA7-/-小鼠的骨髓细胞,然后检测造血重建情况。结果:1、血细胞分析检测结果显示MXRA7基因敲除后,小鼠的红细胞和白细胞没有明显变化,血小板数量比WT小鼠明显降低。2、骨髓组织HE染色及骨髓细胞流式分析结果表明MXRA7-/-小鼠骨髓中巨核细胞略少于野生型小鼠。3、WT和MXRA7-/-小鼠造血干祖细胞的集落形成实验表明CFU-GEMM、CFU-GM、BFU-E的形态或数量均未有明显变化。4、MXRA7-/-小鼠造血干祖细胞诱导分化的巨核细胞比WT小鼠少。5、在血小板功能实验中发现,MXRA7-/-小鼠的血小板活化降低,早期凋亡增加,聚集增强,血块收缩增强,但是尾出血时间和血小板寿命与WT小鼠没有差异。6、sh-MXRA7转染MEG-01细胞成功构建MXRA7敲低的稳定细胞系,而MXRA7的敲低抑制MEG-01的增殖、分化和多倍体形成,并且抑制PPF的形成,巨核细胞发育相关基因GATA1、FOG1、PU-1、NF-E2表达未发生明显变化。进一步的结果表明MXRA7的敲低主要抑制ERK信号的磷酸化、β-Tubulin重排及Bax表达水平。7、小鼠非清髓造血恢复和清髓后骨髓细胞移植实验结果表明MXRA7敲除不影响小鼠的外周血、脾脏和骨髓的细胞数目,也几乎不影响各系血细胞。结论:1、MXRA7的敲除会通过抑制巨核细胞的发育和分化、促进血小板的凋亡来下调血小板的数量。2、体外细胞实验中,MXRA7敲低可以抑制MEG-01细胞的增殖,并通过抑制p-ERK的表达、β-Tubulin重排来抑制向Mk细胞的分化。3、MXRA7的敲除对小鼠的造血恢复和造血重建影响不明显。第二部分 糖基化终末产物对巨核细胞发育分化及造血的调控作用目的:Mk作为血小板的前体细胞,近来被认定为参与造血干细胞静息-活化相互转变的调节细胞,其可以通过与骨髓基质及其他细胞成份相互作用调节造血微环境。而糖尿病是一种严重的全身性疾病,其是否会影响造血和骨髓微环境尚不清楚,糖基化终末产物(AGEs)的过度积累是糖尿病的典型特征,但AGEs也是机体维持内环境稳定和组织重建所必需的。为此,我们选择AGEs为代表研究糖尿病对巨核细胞发育分化及造血微环境调节的作用。方法:1、制备糖化牛血清白蛋白(BSA-AGEs):将BSA与D-葡萄糖在磷酸盐缓冲液(0.2 M,pH 7.4)中孵育8周。孵育后通过PBS(0.2 M,pH 7.4)广泛透析除去未结合糖。孵育在无菌条件下进行。2、AGEs对MEG-01细胞生物学功能及分化的影响:用BSA-AGEs或高浓度葡萄糖进行处理,采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期;PMA诱导巨核祖细胞MEG-01细胞分化,利用流式细胞术检测Mk分化标记、血小板样颗粒;利用实时定量PCR技术检测巨核细胞发育相关基因(NF-E2、GATA1、PU1)和造血微环境调节相关基因(IL-6、VEGFa、PDGFa、PF4、OPG)的表达水平。3、AGEs对TPO/SCF/IL-3诱导人脐血单核细胞向巨核细胞分化的影响:流式细胞术检测AGEs对Mk分化标记、Mk细胞周期分布的影响;利用实时定量PCR技术检测影响巨核细胞发育相关基因的表达水平。4、体内实验利用糖尿病ob/ob小鼠和STZ诱导小鼠糖尿病两种模型观察巨核细胞的发育和造血情况:血细胞计数仪测定小鼠血小板、红细胞、白细胞及骨髓有核细胞总数,流式细胞术测定骨髓中Mk表面标记,骨髓涂片行瑞氏染色后对巨核细胞进行分类。利用实时定量PCR技术检测巨核细胞发育相关基因及其造血微环境调节相关基因的表达水平。5、AGEs对小鼠造血干祖细胞分化的影响:分选小鼠骨髓中的造血干祖细胞,利用集落形成细胞实验评估AGEs对造血干祖细胞的增殖、分化的影响。结果:1、成功制备BSA-AGEs,通过预实验确定200μg/ml作为BSA-AGEs影响MEG-01的最优浓度。2、体外实验中,AGEs促进MEG-01细胞的生长而高糖抑制细胞的生长,AGEs促进其细胞受体RAGE的表达水平,并呈现为时间依赖的增加,但ROS水平没发生变化。3、AGEs增加PF4和VEGFα的mRNA表达水平,而不影响Mk发育相关基因的表达水平,对Mk的分化没有明显的作用,4、在ob/ob小鼠(AGEs升高)和STZ诱导小鼠的短期糖尿病(AGEs正常)条件下,与对照组相比,AGEs升高的ob/ob小鼠血小板数量增加,骨髓中表达CD41的巨核细胞增加,AGEs还会促进Mk发育相关基因的表达;而AGEs正常的STZ诱导的小鼠,血小板数量没有变化,骨髓中表达CD41和CD61巨核细胞会减少,Mk发育相关基因的表达的变化趋势也与AGEs升高的小鼠不同。5、集落形成实验表明AGEs可以促进GEMM集落的形成。结论:1、AGEs改变了 MEG-01细胞的部分生物学特性,并影响部分调控造血微环境相关基因mRNA的表达水平。2、AGEs对TPO/SCF/IL-3诱导脐血细胞分化为巨核细胞的过程没有显著作用。3、Ob/ob小鼠的血小板数量和骨髓中的巨核细胞增加,说明AGEs会影响巨核细胞的发育。