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研究背景:阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病。随着人口老龄化,AD的发病率不断上升。目前AD尚无有效的治疗方法,很多靶向药物的临床试验以失败而告终,对AD的发病机制的深入研究及探索新的治疗措施为当前所需。Cdk5(cyclin-dependent kinase 5,细胞周期依赖性蛋白激酶5)在全身各组织细胞广泛表达,为丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化激酶。其激酶的活性在中枢神经系统被激活,源于神经元富含的激活因子p35。p35结合并激活Cdk5,形成具有活性的Cdk5/p35复合物,是神经元的正常生理功能如神经发育、迁移、突触形成等所必需。然而,p35在不良应激情况下,裂解成p25,p25同样能结合并激活Cdk5,形成高活性的Cdk5/p25。与Cdk5/p35比较,Cdk5/p25结合更紧密,活性更强,在细胞内游离更广,能磷酸化与神经退行性疾病相关的很多底物,导致神经毒性,在AD等神经退行性疾病的发生发展过程中起重要作用。CIP(Cdk5 inhibitorypeptide,Cdk5抑制肽)是第一个被发现能抑制Cdk5/p25高活性的肽(125肽),但由于其分子量大,合成肽难以穿过血脑屏障。本研究拟在APP/PS1双转基因AD鼠模型中探讨利用腺相关病毒(Adeno-associated virus 9,AAV9)作为CIP的载体治疗AD的可能性。AAV9因其能长期稳定在中枢神经系统报道,自身免疫原性低,是中枢神经系统较理想的基因治疗载体。研究目的:1.构建AAV9-GFP-CIP载体表达系统,AAV9病毒包装、纯化2.侧脑室注射AAV9病毒,检测病毒表达时间及部位3.在AD模型鼠及对照鼠的三个月时注射AAV9-GFP-CIP病毒或对照病毒,病毒注射后3个月及7个月后观察CIP治疗对AD模型鼠病理学改变及行为学改变的影响。研究方法:动物模型选择:APP/PS1双转基因鼠。病毒注射方法:所有动物均采用侧脑室注射。病毒注射时间:所有动物均选择小鼠3月龄,因为这个年龄的AD模型鼠已出现了病理改变。小鼠分组:分以下4组,1.WT组(widetype),C57BL/6J小鼠,注射PBS(phosphate-buffered saline);2.AD/PBS 组,APP/PS1 模型鼠注射 PBS 为对照;3.AD/GFP组,APP/PS1模型鼠注射AAV9-GFP病毒溶液为对照;4.AD/CIP组,APP/PS1模型鼠注射AAV9-GFP-CIP病毒溶液。各组小鼠8只,均在3月龄时侧脑室注射。行为学、分子及病理检测:6月龄时,进行动物行为学观察,依次完成Morris水迷宫实验(检测记忆认知功能),穿梭箱主动回避实验(检测记忆认知功能),高架十字迷宫实验(检测焦虑状态)。6月龄小鼠,行活体荧光成像摄像观察CIP表达情况。取脑组织做石蜡标本,免疫组化法观察A β肽沉积、GFAP和Iba1染色分别检测星形胶质细胞及小胶质细胞活化。取脑组织提取蛋白行Western blotting检测tau蛋白磷酸化水平、Iba1表达水平检测小胶质细胞活化,cleaved caspase 3水平检测凋亡。行尼氏染色进行神经元计数检测神经元丢失情况。10月龄小鼠取鼠脑石蜡切片行免疫组化染色,观察Aβ肽沉积,GFAP染色及Iba1染色检测脑细胞炎症反应。结果:1.本实验成功制备了病毒AAV9-GFP-CIP及AAV9-GFP。病毒经侧脑室注射后1周及3月后能检测到绿色荧光的表达。2.AAV9-GFP-CIP治疗后,AD模型鼠tau蛋白磷酸化显著减少。3.AAV9-GFP-CIP治疗后,6月龄及10月龄AD模型鼠A β肽沉积明显减少。4.AAV9-GFP-CIP治疗后,6月龄及10月龄AD模型鼠星形胶质细胞及小胶质细胞活化减轻,凋亡减轻。5.AAV9-GFP-CIP治疗后AD模型鼠记忆认知功能缺损改善,焦虑状态缓解。结论:侧脑室注射AAV9-GFP-CIP病毒后,AD模型鼠记忆认知功能缺损改善,焦虑状态缓解。在病理水平表现为tau蛋白磷酸化、Aβ肽沉积和脑细胞炎症反应及凋亡显著减少。因此,AAV9介导的CIP是AD的治疗有前景的靶向治疗措施。