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心房颤动(Atrial Fibrillation,AF)是一类由遗传因素、环境因素及其相互作用引起的心脏疾病,且发病风险随年龄增长而增加,目前在全世界范围内有超过3000万人受AF影响。尽管近年来在AF患者的管理方面取得了一定进展,但是AF仍然是一个重大的公共卫生问题。此类心律失常引起的血栓仍是导致卒中的主要原因之一,同时,房颤也增加了心衰等心血管疾病和猝死的发病风险。过去研究认为AF是由于涉及离子通道的基因突变导致,比如KCNQ1、KCNH2、SCN5A、SCN3B和GJA5等基因的突变。然而,最新的研究发现一些非离子通道基因如NPPA、NUP155、CAV1和TNNI3的突变也能导致AF或增加AF的易感性。心脏组织的结构重构,促成了心律失常的折返和延续,导致电重构。由于在细胞和亚细胞水平心脏组织的电重构和结构重构使房颤有着渐进性的特点。NPPA基因编码由28个氨基酸构成的心钠肽蛋白(Atrial Natriuretic Peptide,ANP)。心钠肽为利钠肽家族(Natriuretic Peptide family,NPS)成员之一,是一种参与循环的激素。ANP具有强大的利钠、利尿、扩血管、抗交感神经和抑制肾素-醛固酮活动的作用,参与调节电解质平衡和血压。ANP的主要作用受体是A型心钠肽受体(Natriuretic Peptide Receptor A,NPRA)。NPRA是一种鸟苷酸环化酶,能催化产生重要的第二信使c GMP(Cyclic Guanosine Monophosphate)。第二信使c GMP和其下游的效应蛋白激酶G(Protein Kinase G,PKG)能介导细胞内参与压力和生理反应的一系列信号级联过程。在之前的研究中,本课题组选取了384名孤立性房颤患者,对其NPPA基因进行突变筛查。通过对NPPA所有外显子及剪接位点进行一代测序,发现了一个功能未知的新突变p.Ile138Thr。正常ANP由28个氨基酸构成,其中第7和第23位半胱氨酸残基通过一个二硫键相连,而p.Ile138Thr突变正好位于环状部位的中间位置。该区域与受体结合密切相关,且在进化中高度保守,是成熟ANP中高度保守区的第一个导致单个氨基酸改变的突变。然而,该突变与导致房颤的分子机制尚不明确,因此,本课题就此展开了深入研究。第一,我们运用生物信息学程序预测了NPPA基因p.Ile138Thr突变致病的可能性。多个生物信息预测程序表明p.Ile138Thr是有害的。基于2015年美国医学遗传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)标准和指南,p.Ile138Thr可被定义为一种可能致病变异。第二,为了检测突变对受体激活能力的影响,利用免疫共沉淀的方法分别鉴定了w ANP(wildtype ANP)、m ANP(mutant ANP)和其主要受体NPRA的相互作用强度并分别检测了w ANP和m ANP刺激后的胞内c GMP水平。结果表明m ANP激活受体NPRA的能力减弱,同时产生第二信使c GMP能力也减弱。第三,为研究m ANP在动物体内是否会导致房颤或增加房颤的易感性,我们利用TALEN技术构建了NPPA基因p.Ile138Thr突变敲入大鼠。我们选取10周龄、体重介于200g到250g的大鼠,经食道快速刺激心房,记录体表心电图,运用超声技术评价大鼠心脏的收缩功能和舒张功能。同时运用免疫组化等检测心脏切片中相关蛋白和标志物的表达。KI(Knockin)大鼠不仅出现自发的房颤表型,而且相比WT(Wildtype)大鼠,KI大鼠房颤持续时间更长、诱发率更高。第四,为确定KI大鼠心房是否发生结构重构,明确KI大鼠易房颤的机制,我们对大鼠心脏的不同部位进行了Masson三色染色。相比WT大鼠,KI大鼠心房表现出更严重的纤维化,心脏体重比更高,但是心室的纤维化并不显著。超声心动图结果表明KI大鼠有高动力性的左室功能,而心脏的免疫组化实验表明,KI大鼠心脏中IL-1β的表达量显著增高,白细胞的标志物CD45、纤维化相关基因Col1和MMP9,表达均高于WT大鼠。从WT和KI大鼠中分离心肌成纤维细胞和心肌细胞,KI大鼠中成纤维细胞p-p65,p65表达均高于WT大鼠。这些结果说明,KI大鼠心脏呈现出炎症反应和结构重构。第五,用血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)分别联合w ANP和m ANP处理乳鼠心肌成纤维细胞,进行高通量转录组测序。结果显示m ANP处理组中显著富集到了与TNF-α和NF-κB信号通路相关的基因。RT-PCR实验也证实了相比w ANP组,m ANP组中Tnfa的m RNA表达量上调了4倍。KI大鼠心肌成纤维细胞中?-SMA的表达高于WT大鼠。对心脏组织进行成纤维细胞的标志物vimentin和增殖标志物Ki67共同免疫荧光染色,结果表明p.Ile138Thr突变能促进心肌成纤维细胞的增殖。本课题首次运用敲入成熟ANP突变的大鼠模型,研究了NPPA基因p.Ile138Thr突变敲入大鼠在动物体内对房颤易感性的影响。本研究揭示了一个基于成纤维细胞增加房颤易感性的分子机制。m ANP通过减少与受体的结合能力;降低细胞内第二信使c GMP的产生;激活TNF-α和NF-κB信号通路激活,从而诱导炎症反应;加速心脏的结构重构;促进成纤维细胞的增殖,最终造成KI大鼠房颤的发生、增加了易感性。综上,这一研究揭示房颤发生的一种新的分子机制。