伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染引起的一种烈性传染病,猪被认为是PRV的自然宿主和主要传染源,免疫接种弱毒疫苗是防控PR的有效途径之一。二基因缺失（US7/US8缺失）和三基因缺失（US7/US8/UL23）的PRV弱毒疫苗广泛应用于猪伪狂犬病防控,取得了较好的免疫效果。近年来,在我国山东、河北、辽宁和北京等地相继报道犬、水貂等毛皮动物通过接触接种弱毒疫苗猪的生肉或内脏而导致感染PRV,表现为搔痒、发热、呼吸系统障碍和消化系统功能紊乱。犬接种上述弱毒疫苗后发现,弱毒疫苗毒株可在犬群中水平传播且对犬致病。虽然伪狂犬缺失疫苗对猪是安全的,但免疫接种后,在猪群中未被完全清除,而犬等毛皮动物通过接触免疫猪的生肉或内脏而感染发病,对犬等毛皮动物仍然具有高致病性。目前广泛使用的伪狂犬疫苗对犬存在安全问题,亟待进一步改进,降低其毒力。US3基因为疱疹病毒的另一重要的毒力基因,对调控细胞凋亡和和调节宿主免疫反应等也起到关键的作用。本研究应用CRISPR/Cas9技术以r PRV^{del US7/US8/UL23}为亲本株构建US7/US8/UL23/US3四基因缺失毒株,并评价r PRV^{del US7/US8/UL23}和US7/US8/UL23/US3四基因缺失的重组PRV毒株对犬的致病性,以探究其对犬的安全性,从而为伪狂犬的防控提供安全有效的疫苗。本研究首先将PRV US3基因克隆至原核表达载体,进行原核表达后免疫小鼠制备US3抗体血清。然后采用CRISPR/Cas9方法,设计靶向US3基因一对sgRNAs,并将其克隆至表达载体后与r PRV^{delUS7/US8/UL23}基因组进行共转染;48 h后即可看见典型细胞病变（Cytopathic effect,CPE）,72h后收获转染细胞上清液,接种PK-15细胞,进行蚀斑纯化筛选;经过10轮的纯化后通过PCR和Western-blot进行鉴定正确后,将获得的病毒命名为r PRV^{del US7/US8/UL23/US3}。r PRV^{del US7/US8/UL23/US3}病毒遗传稳定,未见缺失回复突变。通过复制动力学试验及细胞病变试验对r PRV^{del US7/US8/UL23/US3}生长能力进行评价,结果表明,与野生型和r PRV^{del US7/US8/UL23}相比,r PRV^{delUS7/US8/UL23/US3}病毒滴度较低,但仍具有良好的复制能力,且感染细胞后未见细胞融合现象发生;通过攻毒后对犬的临床观察、病理变化和组织病毒载量进行致病性分析,结果表明,2×10⁴ TCID₅₀攻毒剂量下,r PRV^{del US7/US8/UL23}对犬致死,而r PRV^{del US7/US8/UL23/US3}攻毒后,犬体温正常,临床症状不明显,病理变化不典型,组织病毒载量降低,不致死,表明PRV^{del US7/US8/UL23/US3}的致病性相比野生型和r PRV^{del US7/US8/UL23}明显减弱。本研究首次揭示了US3基因是PRV疫苗株感染犬后的毒力基因,为PRV疫苗进一步改进提供了理论基础。