视神经损伤是颅脑损伤一种常见的严重并发症,主要表现为持续性视觉功能障碍,可分为直接损伤和间接损伤。视神经直接损伤,常见于颜面部穿通伤,尤其是眼眶骨折碎片直接刺伤视神经。这种损伤直接导致视神经撕裂,甚至完全离断,损伤严重,目前尚无有效的治疗方法。然而,视神经间接损伤临床相对更常见,闭合性颅脑损伤合并间接视神经损伤发生率为0.5%～5%,即使采用视神经管减压术联合激素冲击治疗,效果并不理想,结果常导致视觉功能不可逆性损害。这与视神经病理生理特征有关。视神经由视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的一段轴突所组成。RGCs位于视网膜最内层——神经节细胞层,是视网膜内唯一向脑内投射的一类神经元。从胚胎发生学角度看,视网膜来源于神经外胚层,属于中枢神经系统(central nervous system,CNS)的一部分。因此,视神经虽然名义上属于周围神经系统(peripheral nervous system,PNS),但其本质上却是CNS 一部分,属于CNS白质。尽管包括视神经在内的成年哺乳动物CNS具有一定的再生能力已经得到了证实,CNS再生的研究也已取得一定的进展,但是CNS损伤后自发的再生能力有限,不足以恢复受损的神经功能。研究表明CNS胶质微环境是阻碍CNS再生的重要因素,因此,研究胶质微环境抑制CNS再生的分子机制,对修复视神经损伤或其它CNS损伤具有重要理论和临床意义。成年哺乳动物中CNS髓鞘中Nogo、髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,Omgp)以及胶质瘢痕中硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycans,CSPGs)是抑制 CNS 再生的重要分子。Nogo、MAG 和 Omgp有一个共同受体,即Nogo受体(Nogo receptor,NgR)。NgR是一种糖基磷脂酰肌醇锚链蛋白,缺乏细胞内结构域,不能直接将细胞外信号传导至细胞内。因此,NgR必须与其它跨膜分子形成复合受体后才能将细胞外信号传导至细胞内。肿瘤坏死因子家族成员p75是NgR重要辅助受体。这些分子与其相应受体结合后最终均会激活RhoA/ROCK最后共同通路,活化的ROCK通过激活LIM激酶抑制Cofilin蛋白,导致生长锥萎缩,抑制轴突生长。这是CNS胶质微环境中上述分子抑制CNS再生的共同信号通路。因为p75缺乏GDP/GTP交换因子结构域,不能直接激活RhoA,需要其他分子介导。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)就是介导p75细胞内信号传导,从而抑制成年哺乳动物CNS轴突生长的重要分子。蛋白酪氨酸磷酸酶-σ(protein tyrosine phosphatase-σ,PTP-σ)是CSPGs抑制轴突生长的受体,而CSPGs亦需要激活PKC。因此,PKC是Nogo-A、MAG、Omgp和CSPGs等分子抑制CNS再生的重要调节分子。然而,在成年哺乳动物CNS再生过程中,PKC是否是RhoA上游分子,文献报道不一致。有研究发现大鼠出生后7 d小脑颗粒细胞体外培养实验中,抑制PKC可抑制RhoA活性。而另有研究发现在大鼠出生后7 d小脑神经元体外培养实验中,抑制PKC并不影响RhoA活性。这提示PKC作用的下游信号分子在不同的神经元中可能不一样。大鼠视神经损伤后,包括外伤、炎症、缺氧等,视网膜核转录因子-κB(nuclear transcripter kapper B,NF-κB)和 PKC 表达均明显增加,抑制 PKC 或NF-κB的表达,均能够明显减少RGC凋亡数量。NF-κB是体内重要的转录因子,参与炎症、癌症、神经元变性、糖尿病、中风等一系列病理生理过程。在静息的细胞中,NF-κB以无活性形式存在于胞浆中,当细胞受细胞外信号刺激后,激活NF-κB使游离的NF-κB迅速移位到细胞核,与特异性κB序列结合,诱导相关基因转录,这一过程受PKC调节。PKC激活NF-κB在许多细胞生命活动过程中起重要作用,例如激活B细胞受体,活化磷脂酶C,通过PKC激活NF-κB,促进基因转录,是B细胞发挥功能所必须的;应用脂肪酸合成抑制剂通过PKC抑制NF-κB可明显抑制肺癌细胞增殖。另外,激活NF-κB并转移至细胞核与DNA 结合在细胞因子途径抑制物 3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)表达过程中其重要作用,而且这一过程受PKC调控。而敲除SOCS3基因显著促进成年小鼠视神经再生。因此,我们推测抑制PKC可能通过抑制NF-κB,进而下调SOCS3表达,从而促进大鼠视神经再生。为此,我们拟通过体内实验和体外实验验证这一假设。我们的研究目标:一是应用成年大鼠体坐骨神经移植模型和荧光金逆行标记技术标记再生RGCs,探讨抑制PKC/NF-κB/SOCS3信号通路对成年大鼠视神经再生的作用;二是应用大鼠RGCs体外培养技术,培养基中加入可溶性Nogo-A抑制RGCs轴突生长,阐明髓鞘抑制分子通过PKC调控NF-κB/SOCS3信号通路抑制RGCs轴突再生的机制,为研究髓鞘抑制CNS再生提供一个新思路。体内试验:抑制PKC/NF-κ B/SOCS3信号通路对成年大鼠视神经再生的影响目的:探讨抑制PKC/NF-κ B/SOCS3信号通路对成年大鼠视神经再生的作用。方法:采用自体坐骨神经移植模型和荧光金逆行标记技术标记再生RGCs。将61只成年SD大鼠,按随机数字表法随机分为:对照组(n=17)、DMSO组(n=13)、G66976 组(n=13)、PDTC 组(n=9)、PBS 组(n=9)。动物干预方法:①DMSO组,造模后玻璃体内注射5μlDMSO(Go6976溶剂),每隔5天一次,直至处死大鼠;②Go6976组,造模后玻璃体内注射PKC抑制剂Go6976 5μl(浓度为5μmol/L),每隔5天一次,直至处死大鼠;③PDTC组,造模后腹腔注射1ml NF-κB p65抑制剂PDTC(浓度为20 mg/ml),每天一次,直至处死大鼠;④PBS组,造模后腹腔注射1ml PBS(PDTC溶剂),每天一次,直至处死大鼠;⑤对照组不给予任何上述试剂干预。自体坐骨神经移植术后4周,每组取5只大鼠采用视网膜平铺技术计数再生RGC数量;对照组剩下12只大鼠进行视网膜PKC活性(n=4)、NF-κB p65磷酸化水平(n=4)和SOCS3蛋白表达水平分析(n=4),DMSO组和Go6976组进行视网膜NF-κB p65磷酸化水平(n=4)和SOCS3蛋白表达水平分析(n=4);PBS组和PDTC组进行视网膜SOCS3蛋白表达水平分析(n=4)。另取12只正常大鼠应用PepTag非同位素PKC检测试剂盒检测视网膜PKC活性(n=4),应用Western blotting分析视网膜NF-κB p65磷酸化水平(n=4)和SOCS3蛋蛋表达水平(n=)。应应用SPS 18.0软件进行统计学分析,定量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用Tukey检验;两组之间比较,采用独立样本t检验;P≤0.05为差异具有统计学意义。结果:①各组视网膜PKC活性、NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平变化:对照组视网膜PKC活性、NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平较正常组均明显增高(P<0.05);Go6976组视网膜NF-κBp65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平较对照组均明显降低(P<0.05),但DMSO组与对照组之间无统计学差异(P>0.05);PDTC组视网膜SOCS3蛋白表达水平较对照组均明显降低(P<0.05),但PBS组与对照组无统计学差异(P>0.05)。②抑制PKC对成年大鼠再生RGCs数量的影响:对照组再生RGCs数量与DMSO组之间无统计学差异(P>0.05);Go6976组再生RGCs数量明显高于对照组和DMSO组(P<0.01)。③抑制NF-κB对成年大鼠RGCs再生数量的影响:PBS组再生RGCs数量与对照组无统计学差异(P>0.05);PDTC组再生RGCs数量明显高于对照组和 PBS 组(P<0.01)。结论:成年大鼠视神经损伤后,视网膜PKC活性明显增加,NF-κB p65磷酸化水平明显升高,SOCS3蛋白表达水平显著增高;抑制PKC显著降低NF-κB p65磷酸化水平,同时降低SOCS3蛋白表达水平,抑制NF-κB p65显著下调SOCS3表达。抑制PKC和NF-κB均显著增加成年大鼠视神经损伤后再生RGCs数量。这提示抑制PKC可能通过NF-κB介导下调SOCS3表达,从而促进成年大鼠视神经再生。体外实验:PKC/NF-κB/SOCS3信号通路在Nogo-A抑制体外培养成的年大鼠RGCs轴突生长中的作用目的:探讨PKC/NF-κB/SOCS3信号通路在体外培养的大鼠RGCs轴突生长中的作用。方法:应用SD幼鼠RGCs体外培养技术,培养基中加入可溶性Nogo-A抑制RGCs轴突生长。实验分组:①正常组,分离出生后1周SD幼鼠RGCs进行体外培养;②Nogo-A组,培养基内加入可溶性Nogo-A处理;③Go6976组,培养基内加入可溶性Nogo-A,同时加入PKC抑制剂Go6976处理;④PDTC组,培养基内加入可溶性Nogo-A,同时加入NF-κB抑制剂PDTC处理;⑤SOCS3-siRNA组,培养基内加入可溶性Nogo-A,同时加入SOCS3 siRNA沉默SOCS3基因表达。每组设4个复孔。应用PepTag非同位素PKC检测试剂盒检测RGCs PKC活性,应用Western blotting分析NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平;应用βⅢ-tubulin免疫组化染色分析RGCs轴突生长情况,每组每孔测量50个RGCs最长的突起,取平均值。应用SPSS 18.0软件进行统计学分析,定量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用Tukey检验;两组之间比较,采用Mann-whitneyU检验;P≤0.05为差异具有统计学意义。结果:Nogo-A组PKC活性、NF-κκB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平较正常组均明显增高(P<0.05);Go6976组PKC活性、NF-κBp65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平较Nogo-A组均明显降低(P<0.05);PDTC组NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平较Nogo-A组均明显降低(P<0.05),但是PKC活性与Nogo-A无统计学差异(P>0.05);SOCS3-siRNA组SOCS3蛋白表达水平较Nogo-A组明显降低(P<0.01),但是PKC活性和NF-κB p65磷酸化水平与Nogo-A组均无统计学差异(P>0.05);Go6976+PDTC组PKC活性、NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平与Go6976组无统计学差异(P>0.05);PDTC+SOCS3-siRNA组NF-κB p65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平与PDTC组无统计学差异(P>0.05),PKC活性与Nogo-A组无统计学差异(P>0.05)。Nogo-A组RGC轴突长度为较正常组明显缩短(P<0.05);Go6976组、PDTC组和SOCS3-siRNA组RGC轴突长度均较Nogo-A组明显延长(P<0.05)。结论:Nogo-A可明显增加体外培养大鼠RGCsPKC活性,显著增高NF-κB p65磷酸化,上调SOCS3表达;抑制PKC显著降低体外培养RGC中NF-κBp65磷酸化水平和SOCS3蛋白表达水平;抑制NF-κB显著下调体外培养RGC中SOCS3蛋白表达水平。抑制PKC、NF-κB和SOCS3均能够促进体外培养RGCs轴突生长。这提示Nogo-A可通过激活PKC,经NF-κB介导,上调SOCS3表达,从而抑制体外培养的大鼠RGCs轴突生长。