目的　　流行性感冒病毒(Influenzavirus)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分为甲、乙、丙三型。其中甲型流感病毒变异和传播速度快，成为严重威胁人类健康的常见病原体之一。流感病毒为分节段的RNA病毒，容易发生抗原漂移(antigenicdrift)和抗原转换(antigenicshift)，尤其是表面糖蛋白抗原血凝素(hemagglutinin，HA)最易发生变异，使流感在人群中不断形成新的流行。目前使用的流感疫苗只含几种常见流行株，主要是诱导机体产生HA特异性中和抗体，只对所含型别有效，对变异株无效。世界卫生组织根据每年流感流行情况，对疫苗组合进行调整，而疫苗的研制常常滞后于流感病毒抗原的变异。所以，研发可以抵御所有型别流感病毒感染的“通用型”疫苗成为迫切的任务。　　目前已发现不同型流感病毒感染存在交叉保护作用，而具体机制并不明确。研究人员考虑能否通过提高细胞免疫的方法，达到预防异型流感病毒感染的目的。那么究竟哪种细胞免疫反应在抗异型流感病毒免疫中起到了主要作用？其机制是什么？能否通过增强此种作用而达到清除异型流感病毒感染的目的？这些问题尚无统一的结论。本实验室前期的研究发现，与免疫型别不同流感病毒（异型）感染的小鼠与同型感染小鼠相比，IFN-γ水平显著增高。IFN-γ具有多种免疫功能，其一即为激活NK细胞，增强其清除感染细胞的能力。IL-2可促进NK细胞增殖，维持NK细胞生长，在体内外都能增强NK细胞活性。因此本实验将分别研究小鼠NK细胞水平及增殖活性在同型感染、异型感染、IL-2增强组中的变化情况，分析NK细胞在抗异型流感病毒感染中的作用，为流感“通用”疫苗的开发提供更多的相关依据。　　方法　　一、病毒滴度测定　　将H1N1流感病毒的病毒储存液用PBS进行10倍等比稀释(10-1-10-10)，把各稀释液分别接种于9日龄鸡胚尿囊腔中，33-35℃孵箱培养，根据Reed-Muench方法，计算鸡胚半数感染量。　　二、动物分组　　6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，随机分成实验组和对照组　　1.异型流感病毒感染研究　　实验1组（同型免疫组）:用A/H1N1流感病毒免疫，A/H1N1型流感病毒感染;实验2组（异型免疫组）:用A/H5N1型流感病毒疫苗免疫，A/H1N1型流感病毒感染;对照1组（未免疫感染对照组）:用PBS代替疫苗，A/H1N1型流感病毒感染;对照2组（空白对照组）:正常饲养，不做任何处置。　　2.应用IL-2后异型流感病毒感染研究　　实验1组（异型免疫组）:用A/H5N1流感病毒疫苗免疫，A/H1N1流感病毒感染;实验2组（异型免疫加强组）:用A/H5N1流感病毒疫苗免疫，IL-2加强免疫，A/H1N1流感病毒感染;对照1组（单纯使用IL-2组）:只用IL-2后感染A/H1N1流感病毒;对照2组（未免疫感染对照组）:用PBS代替疫苗，感染A/H1N1流感病毒;对照3组（空白对照组）:正常饲养，不做任何处置。　　三、免疫动物　　用A/H1N1流感病毒或A/H5N1流感病毒疫苗按上述分组参照说明书免疫动物。使用IL-2组，免疫的第0，1，2天腹腔注射IL-2。首次免疫三周后加强免疫一次，方法剂量同上。　　四、感染动物　　二次免疫两周后，按上述分组每只小鼠经鼻腔感染A/H1N1型流感病毒。感染后正常饲喂小鼠，每天称量体重，观察饮食饮水及活动与精神状态。　　五、MTT法测定NK细胞杀伤活性　　于小鼠感染前1天、感染后第4、7天无菌解剖取脾制备效应细胞，YAC-1细胞为靶细胞，样本混匀接种于96孔板，每个样本3个复孔，孵箱内设5％CO2，37℃，孵育4小时后进行MTT实验，酶标仪570nm处测OD值。　　六、流式细胞仪测NK细胞数量百分比　　分别于感染前、感染后4天、7天取小鼠脾细胞。悬起调节浓度后，加入表面抗体CD3-PerCP，CD49b-FITC，NKG2D-PE，混匀，孵育后在流式细胞仪读取数据。　　七、统计学分析　　用SPSS17.0进行统计分析，P＜0.05为统计学差异显著。　　结果　　①H5N1-H1N1组小鼠生存率高于无免疫对照组;H5N1+IL-2-H1N1组小鼠生存率高于H5N1-H1N1组。　　②H5N1-H1N1组小鼠NK细胞杀伤活性显著高于H1N1-H1N1组和未免疫对照组;H5N1-H1N1组NK细胞的NKG2D+表达率显著高于未免疫对照组。　　③H5N1+IL-2-H1N1组NK细胞杀伤活性显著高于未免疫对照组，并且显著高于单纯应用IL-2对照组。　　结论　　①流感病毒异型间存在交叉免疫作用。免疫佐剂IL-2能够在一定程度上增强流感病毒异型间的交叉保护作用。　　②异型流感病毒感染中，NK细胞表面活化受体NKG2D显著增多，NK细胞活性显著升高。