论文部分内容阅读
目的应用高免疫状态的人血液提取DNA，克隆人白介素-10（IL-10）基因，以真核表达载体pcDNA4／HisMaxB质粒构建重组的人IL-10表达载体（pcDNA4／hIL-10），体外转染培养的新西兰大白兔角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞，研究人IL-10基因在角膜细胞的基因转移技术和基因转移后的蛋白质表达规律；采用pcDNA4／hIL-10在眼结膜下注射和眼前房内注射法转移基因，观察pcDNA4／hIL-10重组基因在角膜移植排斥反应控制中的作用，对角膜移植排斥反应的基因治疗进行探索性研究。材料和方法1、取高免疫状态的人血清提取人DNA，设计人白介素10（human interleukin-10，hIL-10）基因的特异性引物，进行hIL-10基因的克隆、提纯、鉴定，以pcDNA4／HisMaxB质粒为载体构建pcDNA4／hIL-10重组表达载体，纯化质粒。2、取新西兰大白兔角膜，分别培养角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞，以新一代高效原代细胞基因转染试剂EffecteneTM转移基因。首先在培养的兔角膜原代细胞中转染绿色荧光蛋白（green fluorecentprotein，GFP）报道基因，在普通荧光显微镜观察绿色荧光的角膜培养细胞，确定转染效率。在转染GFP基因的基础上，体外培养细胞转染pcDNA4／hIL-10重组质粒，在转染后的不同时间应用ELISA方法、免疫组织化学方法和免疫荧光组织化学方法分析hIL-10基因在转染角膜细胞后，培养的角膜细胞中人IL-10蛋白质合成、表达和细胞对IL-10的外分泌功能。3、制做新西兰大白兔角膜碱烧伤新生血管模型，常规进行同种异体角膜移植，在角膜排斥反应征象出现时，应用pcDNA4／hIL-10进行基因转移治疗，探索hIL-10基因在抑制角膜移植排斥反应中的作用。结果1、由人全血基因组DNA中克隆的IL-10基因，以pcDNA4／HisMaxB质粒重组pcDNA4／h IL-10表达载体稳定可靠。2、新一代原代细胞转染试剂EffecteneTM可以高效转染基因，GFP报道基因在转染后20h培养的三种角膜细胞均可见荧光细胞，瞬时转染36h以内即达高峰，此后荧光渐降低，可以见很少的荧光细胞持续5天以上。3、重组表达载体pcDNA4／hIL-10体外转染兔角膜三种细胞后，36h时测量hIL-10蛋白，此时细胞外液分泌量最高，72h后应用ELISA法检测培养液呈阴性。免疫组织化学法检测IL-10蛋白显示，pcDNA4／hIL-10重组载体转染培养的兔角膜细胞后，蛋白质表达位于细胞浆内，免疫荧光共聚焦显微镜观察见IL-10染色阳性表达细胞形态与培养时的形态一致。4、新西兰大白兔体内转染pcDNA4／hIL-10重组表达载体，对于严重角膜新生血管排斥反应模型均未能抑制排斥反应，其原因是多方面的，有待于进一步探索。结论人重组pcDNA4／hIL-10表达载体在培养的角膜细胞模型中，转染后hIL-10蛋白质在细胞浆中可见表达，并产生外分泌，细胞外液中ELISA法检测蛋白含量明显升高。人pcDNA4／hIL-10重组载体尽管未能控制角膜移植的排斥反应，其可能与基因治疗的给药途径、最佳试剂剂量控制、用药最佳时间、排斥反应模型的严重程度等密切相关。目前有大量IL-10基因或IL-10延长心脏、肝脏等移植物存活时间的报道，进行本项研究，将有利于角膜移植排斥反应基因治疗的进一步探讨。